寄主中萜类挥发物质对梨小食心虫的引诱作用

相会明，李先伟，马瑞燕

（山西农业大学 植物保护学院，山西 太谷030801）

梨小食心虫，简称“梨小”，属鳞翅目（Lepidoptera）、卷蛾科（Tortricidae），是一种重要的蛀果性害虫，广泛分布于我国主要桃梨产区［1］。梨小寄主范围集中在蔷薇科的核果类和仁果类果树，其中桃被认为是第一寄主，梨为第二寄主。梨小具有寄主转移的为害特性，幼虫在春季蛀食桃树嫩梢，而在秋季为害桃、梨和苹果等的果实［2］。多年来梨小的生物防治研究主要在以性信息素为基础的大量诱捕和迷向防治领域，由于梨小具有钻蛀性强、寄主转移和雌蛾飞行能力强等特点，导致这种防治手段存在多种弊端［3］。鉴于此，在梨小治理过程中，针对雌蛾的防治比雄蛾防治更加有效。

植物的次生物质在昆虫和植物的协同进化过程中发挥重要作用［4］，如植食性昆虫主要依赖寄主挥发物质进行寄主定向和产卵选择，因此可以利用寄主植物的挥发物进行害虫监测与治理［5］。梨小寄主定位与挥发物之间的关系近年来受到国内外研究者广泛关注。Natele［6］等通过室内嗅觉双选试验发现，苯甲醛、Z-3-己烯醇和Z-3-己烯乙酸酯按照4∶1∶1体积比组成的混合物对梨小雌蛾有较强的引诱作用。国内学者通过田间试验验证，梨果中的挥发物对梨小雌雄蛾均具有引诱活性，但在田间的诱蛾量偏少［7］。目前国内外关于梨小雌蛾引诱活性物质的研究多集中于寄主挥发物中的天然混合物，且田间诱蛾效果较差。针对寄主挥发物中的单一挥发性萜类在梨小寄主定位中的作用及机制并未开展研究。大量研究指出，短链萜类（C5-C20）化合物是植食性昆虫远距离通讯的重要化学物质［8］。因此，探索寄主挥发物中的萜类化合物在梨小雌蛾寄主定位中的作用，并开发梨小雌蛾的植物引诱剂势在必行。

本研究采用气质联用仪（GC-MS）对桃梢挥发物中的萜类物质进行分析，通过田间试验研究桃梢挥发物中萜类物质对于梨小的引诱作用，并进一步探究萜类物质对梨小性信息素是否具增效作用。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 供试植物

供试植物为桃树新梢，桃树品种为“大久保”，种植于山西省农科院果树所桃资源圃，树龄10年。

1.1.2 仪器和试剂

试剂：Z-β-罗勒烯（异构体混合物，含量≥90%，Sigma-Aldrich有限公司），α-法呢烯（异构体混合物，含量≥90%，Sigma-Aldrich有限公司），α-蒎烯（98%，阿拉丁试剂有限公司），正己烷（色谱级，阿拉丁试剂有限公司），吸附剂ProPak Q（80目，色谱科），梨小性诱芯包含200μg梨小性信息素（北京格瑞碧源公司提供）。

仪器：QC-1S型大气采样仪（北京劳动保护研究所），移液枪（艾本德有限公司）7890A-5975C型气相色谱与质谱联用仪（美国安捷伦科技有限公司），三角型诱捕器（北京格瑞碧源公司）。

挥发物顶空吸附装置：用聚四氟乙烯管将QC-1S型大气采样仪、装有活性炭和分子筛的过滤瓶、10 L玻璃采样罐（直径20 cm，上部有进气孔和出气孔）及吸附管（100 mg吸附剂）按顺序连接而成。

1.2 方法

1.2.1 桃梢挥发物的提取

将3枝桃梢置于采样罐内，连接装置，大气采样仪流量设置为200 mL·min-1，室温下抽提4 h。抽提结束后，立即采用2 mL正己烷对吸附管进行洗脱，洗脱液于样品瓶中−18℃保存。进样前，用氮气将洗脱液浓缩至每样品瓶100μL。本试验共重复6次。

1.2.2 桃梢挥发物的分析

将浓缩后的洗脱液于GC-MS中进行分析。进样量为1μL。GC-MS分析条件如下：

（1）气相色谱条件：

色 谱 柱：HP-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；氦气做载气，流量为3 mL·min-1；采用不分流模式进样，进样口温度：230℃；柱箱起始温度50℃，保持3 min，以3℃·min-1程序升温至120℃，再以8℃·min-1升温至240℃，保持5 min。

（2）质谱条件为：

离子源：EI源，电子能量70 eV；离子源温度：230℃；单重四极杆温度：150℃；全扫描，溶剂延时3 min；物质定性采用nist08标准谱图数据库比对，相似度高于85%。

1.2.3 萜类物质诱蛾活性的测定

本 试 验 于2016年5月30日-2016年6月15日在山西省太谷县井神村桃园进行。每个空白诱芯中添加一定剂量的单一萜类化合物，化合物剂量梯度为：0.1、1、10、100 mg。将诱芯置于三角型诱捕器内部，距离粘虫板上方2 cm。随后将诱捕器悬挂于桃树阴凉处，距离地面1.5 m左右，每2个诱捕器间距为25 m。每一剂量处理设置3个重复，每个重复包含6个诱捕器，所有诱捕器随机悬挂。分别以不添加任何化合物的空白诱芯（CK）作为对照。每3天收集一次粘虫板，带回实验室鉴定所诱梨小性别并统计诱蛾量。

1.2.4 萜类物质对梨小性信息素增效作用测定

在梨小性诱芯中添加不同剂量的萜类化合物测试寄主挥发物中的萜类物质对梨小性信息素增效作用。同时使用梨小性诱芯为对照，每个处理3个重复，每个重复设置6个诱捕器，诱捕器及诱芯田间设置与1.2.3中田间设置相同。试验时间为：2016年8月6日-2016年8月24日，试 验 地 点 为 山西省太谷县西山底村桃园。

1.2.5 数据分析

桃梢挥发物相对含量分析采用面积归一化法。每天田间平均诱蛾量经余弦转换后，采用单因素方差分析，并使用Tukey’s HSD进行多重比较检验。所有数据使用SPSS16.0软件进行分析。

2 结果与分析

2.1 桃梢挥发物鉴定

采用动态顶空吸附结合GC-MS对桃梢挥发物进行分析（图1），结果表明（表1）桃梢中共检测到13种挥发性化合物，其中包括萜烯类、醇类、醛类和酯类四大类。在4类物质中，萜烯类物质含量最高，占总挥发物含量80%以上，其中5种主要萜烯的含量顺序为Z-β-罗勒烯（73.47%）、α-法呢烯（8.07%）、β-法 呢 烯（0.81%）、E-β-罗 勒 烯（0.65%）和α-蒎烯（0.36%）。醇类化合物中，芳樟醇（2.7%）的含量高于Z-3-己烯醇（0.21%）。此外，检测到3种醛类物质，含量顺序由高到低依次为：苯甲醛（3.41%）、癸醛（0.93%）和壬醛（0.61%）。在检测到的3种酯类化合物中，水杨酸甲酯的含量最高。

图1 桃梢挥发物气相色谱图Fig1 Gas chromatogram of volatiles in peach shoots

2.2 萜类物质诱蛾活性测定结果

田间试验测定了Z-β-罗勒烯、α-法呢烯和α-蒎烯在4个剂量下对梨小的引诱作用，结果如图2所示。由图2可以看出，1 mg剂量的Z-β-罗勒烯对梨小的引诱作用（65.86±23.12头）显著高于其他3种剂量处理，其诱蛾效果为梨小性信息素的75.2%。4种剂量Z-β-罗勒烯的诱蛾量均显著低于梨小性信息素的诱蛾量（87.58±24.46头）（F5，107=3.38，P=0.026）。4种剂量α-法呢烯的诱蛾量均显著低于梨小性信息素诱蛾量（F5，107=10.473，P=0.038），且4种剂量的诱蛾量差异不显著。100 mgα-蒎烯的诱蛾量（5.61±3.24头）显著低于其他3种剂量的α-蒎烯的诱蛾量（F5，107=11.54，P=0.016），且其他3种剂量α-蒎烯对梨小的引诱量差异不显著。所有处理的诱蛾量均显著高于空白对照，且所有诱捕器中所诱梨小均为雄蛾（图2）。

2.3 萜类物质对梨小性信息素增效作用

萜类物质对梨小性信息素的增效作用田间试验结果见图3。由图3可以看出，与单独使用梨小性诱剂相比，1 mg Z-β-罗勒烯对梨小性诱芯具有显著的增效作用（F4，89=10.86，P＜0.05），可提高诱捕数量的1.5倍，但其他剂量Z-β-罗勒烯对梨小性诱剂增效作用不显著。梨小性诱芯中添加1 mgα-法呢烯可以显著提高梨小性诱芯的诱蛾量（F4，89=16.35，P＜0.05），其他剂量法呢烯的增效不显著。4种剂量的α-蒎烯对梨小性诱剂的增效作用均不显著（F4，89=33.69，P=0.58）。

图2 萜类物质剂量对梨小雄蛾诱蛾量影响Fig 2 Effects of terpenoids at different doses on the mean catching number of male OFM

表1 桃梢主要挥发物成分Table1 Main volatile components in peach shoots

3 讨论

萜烯类物质在卷叶蛾科果树害虫的寄主转移与产卵选择过程中起关键作用。在苹果蠹蛾从苹果树嫩梢向成熟苹果转移过程中，α-法呢烯是引起寄主转移机制的主要嗅觉因素［9］。经行为学验证，α-法尼烯和E-β-石竹烯对葡萄花翅小卷蛾产卵场所选择行为有重要影响［10］。而根据我们的萜类物质田间诱蛾试验结果，所有处理只引诱到梨小雄蛾，未引诱到梨小雌蛾。Il’ichev等［11］将Z-3-己烯乙酸酯、E-β-罗勒烯和E-β-法尼烯按照比例1∶2∶2组成的混合诱芯进行田间试验，结果发现混合诱芯仅对梨小雄蛾有引诱作用。田间试验中，萜类物质未诱到梨小雌蛾的原因可能与梨小食心虫寄主识别过程中其他因素有关。有文献报道，梨小雌蛾偏好在黄色和绿色基质上产卵［12］。此外，宫庆涛等［13］通过研究梨小食心虫产卵与桃果品种关系，指出寄主表面绒毛的疏密程度是影响梨小食心虫产卵选择的首要物理因素，且油桃上梨小产卵量为毛桃40倍。寄主植物的物理特征也是植食性昆虫寄主识别的重要线索［14］。因此，在开发梨小食心虫雌蛾引诱剂设计过程中，不仅关注梨小寄主挥发物，而且需要考虑寄主的形态、颜色和表面结构对梨小食心虫寄主定位行为的影响。

目前针对植食性昆虫性信息素增效作用的研究，多以绿叶类挥发物质为主，而萜类物质较少［15］。本文首次揭示了寄主植物中的萜类物质对梨小食心虫性信息素具有增效作用。寄主植物中的挥发性萜类物质，对其它鳞翅目害虫亦具有增效作用。比如，在美国白蛾（Hyphantria Cunea）性诱芯中添加少量β-罗勒烯，显著提升诱芯的诱捕量［16］。苹果蠹蛾雄虫在法呢烯存在条件下，对其性信息素反应强度显著提高［17］。因此在鳞翅目害虫性信息素增效剂的研究工作中，寄主中的挥发性萜类物质应作为重点对象。

植物挥发物对昆虫性信息素的增效作用取决于化合物的种类和剂量。本研究结果表明，1 mg的Z-β-罗勒烯和α-法呢烯对梨小食心虫性信息素增效作用显著。当Z-β-罗勒烯剂量大于1 mg后，增效作用随剂量呈负相关。在绿叶挥发物对梨小食心虫性信息素有增效作用研究中指出，50μg的Z-3-己烯乙酸酯增加梨小性诱剂的诱捕量，200μg的Z-3-己烯乙酸酯降低梨小性信息素的诱捕能力［18］。沈幼莲等［19］的研究发现，0.4 mg的苯乙醛可以显著提高斜纹夜蛾Spodoptera litura的性诱剂引诱效果，高剂量的苯乙醛有抑制作用。在开发昆虫性信息素增效剂过程中，需关注增效剂的种类与剂量。

4 结论

图3 萜类物质剂量对梨小性信息素增效作用影响Fig.3 Effects of the mixtures of terpenoids at different doses and sex lure on mean catches of male OFM

本研究通过GC-MS对桃梢挥发性物质进行分析，Z-β-罗勒烯、E-β-罗勒烯、α-法呢烯、β-法呢烯、和α-蒎烯等5种萜类化合物被检出。在桃梢挥发物中，Z-β-罗勒烯占总挥发物的73.47%。田间诱蛾试验发现，1 mg剂量的β-罗勒烯对梨小雄蛾的诱蛾活性显著高于其他处理。田间增效试验结果表明，1 mgβ-罗勒烯或法呢烯对梨小性信息素增效作用最强。两种萜类化合物与梨小性信息素的协同增效作用，为开发梨小新型引诱剂及梨小食心虫的综合治理提新的依据和思路。