衣藻和固氮鱼腥藻对盐胁迫下小麦幼苗生长的影响

边建文，崔 岩，杨宋琪，罗光宏，*，孟宪刚

(1.兰州交通大学 化学与生物工程学院，甘肃 兰州 730070； 2.河西学院 甘肃省微藻工程技术研究中心，甘肃 张掖 734000)

盐渍土通常氮、碳、磷含量较低，电导率较高，并含有一些有毒离子，极大地限制了植物的生长[1]。据统计，我国盐渍土总面积约为3.6×107hm2，占全国可利用土地面积的4.88%，西北、华北、东北和沿海地区是我国盐渍土的主要集中分布地区，其中，西部6省区(陕西、甘肃、宁夏、青海、内蒙古、新疆)盐渍土面积占全国的69.03%[2]。土壤盐渍化严重影响作物生长。研究表明，土壤中的盐分通过渗透胁迫和离子效应等途径影响种子萌发和幼苗根系的生长，从而导致作物生长缓慢[3]。小麦是我国主要的粮食作物之一，产量仅次于水稻，在国民经济中占重要地位，同时也是目前盐碱地上种植的主要经济作物[4]。盐胁迫使得小麦生长受阻，光合系统和酶系统受到干扰，进而影响小麦产量和质量[5]。

微藻是一类光合利用度高的低等自养生物，分布广泛，种类繁多，具有固碳、固氮等特性[6]。研究表明，微藻细胞能分泌多聚阴离子大分子胞外多糖(EPS)黏液层，对Na+有强吸附能力，具有优良的脱盐效果[7]。张巍[8]研究发现，固氮蓝藻对盐碱土有一定的改良作用：土壤中的有机质含量从178.4 mg·L-1提高到196.15 mg·L-1，土壤含氮量从8.9 mg·L-1提高到18.16 mg·L-1，土壤交换性钠含量从3.68 mg·L-1降到0.51 mg·L-1，土壤pH值下降到8.0以下，土壤微生物数量由5.92×107CFU·g-1(以干土计)增加到7.91×107CFU·g-1。徐嘉男[9]利用螺旋藻和紫球藻改良盐碱土，发现螺旋藻可以使土壤有机质含量增加到19.60 g·kg-1，紫球藻分泌的可溶性多糖能够吸附土壤中的Na+，使可交换性钠含量降低0.10 cmol·kg-1，土壤碱化度降低至16.30%，土壤pH值降至8.3。Nisha等[10]利用蓝藻作为生物肥料来修复盐渍土，发现盐碱地土壤中总氮含量增加了16%，总有机碳含量增加了12%，有效磷含量增加了17%，同时提高了珍珠粟和小麦的产量。以上研究说明，可以利用藻类来缓解土壤的盐渍化问题，进而改善作物生长。

本试验首次研究了衣藻和固氮鱼腥藻2种微藻藻液对盐胁迫条件下小麦幼苗生长的影响，通过观察不同处理下小麦幼苗的生长状况，及其叶绿素含量和抗氧化酶活性的变化，探究可能的作用机制，旨在为盐渍土改良和小麦种植提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试衣藻系作者团队从当地土壤中分离纯化获得，经鉴定为德巴衣藻(ChlamydomonasdebaryanaGor.，藻种鉴定序列号：JN903975.1)，用TAP培养基培养。固氮鱼腥藻(AnabaenaazoticaLey.)FACHB-119，购于中国科学院淡水藻种库，用BG11培养基培养。小麦种子(永良4号)购于当地种子市场。

取对数生长期的衣藻(藻密度0.5 g·L-1)和固氮鱼腥藻(藻密度0.4 g·L-1)按体积比1∶1的比例制备成混合藻液，然后将衣藻藻液、固氮鱼腥藻藻液和混合藻液分别稀释50倍，作为试验用藻液。

1.2 试验设计

挑选颗粒饱满、大小一致的小麦种子，用3%(体积分数)H2O2消毒，然后用无菌水冲洗3～4次，将冲洗的种子置于铺有滤纸、直径10 cm的玻璃培养皿中，25 °C恒温培养箱中培养2 d。

选取若干规格一致(15.0 cm×9.0 cm×10.5 cm)的花盆，每盆称取500 g砂质土壤。在移栽种子前2 d，取100 mL稀释后的藻液浇灌到土壤中，以纯水作为对照(CK)。每个处理重复3次。种子发芽后，挑取发芽势基本一致的种子移栽到土壤中进行盆栽试验，每盆栽种16棵。室温自然光照下培育，隔1 d浇定量纯水。待小麦幼苗长至两叶一心时，取0、50、100、200 mmol·L-1NaCl溶液各100 mL浇灌到小麦幼苗根部，每天随机选取6株幼苗测定叶片光系统Ⅱ(PSⅡ)最大光化学量子效率(Fv/Fm)变化，采用Handy PEA植物效率分析仪(英国Hansatech公司)测定，连续测定7 d[5，11-12]。生长12 d后测定下列指标：小麦茎长、根长，采用直尺测量；地上部分、地下部分鲜重，采用BSA224S-CW型分析天平[赛多利斯科学仪器(北京)有限公司]称量；叶绿素含量，采用85%(体积分数)丙酮提取，参照文献[13]中的方法进行测定；超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)活性，参照文献[13]中的方法进行测定。

1.3 数据分析

试验数据采用Excel 2010进行整理，用SPSS 21.0软件进行方差分析，用OriginPro 8.5软件制图。

2 结果与分析

2.1 微藻藻液对盐胁迫下小麦茎长和根长的影响

如图1所示，各处理的小麦茎长在13.09～17.78 cm，根长在11.58～15.02 cm。当不添加NaCl(NaCl浓度为0)时，与纯水对照相比：施加3种藻液(混合藻液、衣藻藻液、固氮鱼腥藻藻液)均显著(P<0.05)增加了小麦茎长，增幅分别为8.8%、14.7%和10.9%，但对小麦根长并无显著的促进作用。在50 mmol·L-1NaCl处理下，混合藻液处理的小麦的茎长最长，且显著(P<0.05)高于纯水对照，而各处理的小麦根长无显著差异。50 mmol·L-1NaCl处理下纯水对照组的小麦茎长和根长较不添加NaCl时分别提高了9.4%和2.2%，说明50 mmol·L-1的NaCl可以促进小麦生长；但当NaCl浓度提高到100 mmol·L-1，时，小麦茎长仅增加1.5%，根长降低5.3%，说明小麦根的生长受到了抑制。在100 mmol·L-1NaCl处理下，施加3种藻液均显著(P<0.05)增加了小麦茎长，增幅分别为12.6%、11.0%和10.3%，但对小麦根长无显著作用。在200 mmol·L-1NaCl处理下，纯水对照组的小麦茎长和根长受到明显抑制，施加3种藻液处理后，小麦的茎长较纯水对照组分别显著(P<0.05)增加20.5%、24.9%和18.2%，同时，施加混合藻液的小麦根长亦显著(P<0.05)增加10.2%，但上述指标的值相较于其他NaCl浓度下仍较小，说明施加微藻能够在一定限度上缓解盐胁迫对小麦茎长和根长的抑制作用。

相同NaCl浓度下，柱上无相同字母的表示处理间差异显著(P<0.05)。下同。Bars marked without the same letters indicated significant difference at P<0.05 under the same NaCl concentration. The same as below.图1 不同微藻处理对盐胁迫下小麦茎长和根长的影响Fig.1 Effect of different microalgae treatments on wheat stem length and root length under NaCl stress

2.2 微藻藻液对盐胁迫下小麦地上部和地下部鲜重的影响

如图2所示，随着NaCl浓度增加(50～200 mmol·L-1)，小麦地上部和地下部鲜重均有不同程度的降低，说明在较高的NaCl浓度下，小麦生长受到了抑制。当不添加NaCl时，相较于纯水对照，施加3种藻液均显著(P<0.05)提高了小麦地上部鲜重，增幅分别为15.5%、22.4%和11.4%，施加混合藻液后小麦的地下部鲜重亦显著(P<0.05)提高了21.5%，说明施加微藻液可以促进小麦生长。在50 mmol·L-1NaCl处理下，施加混合藻液的小麦地上部和地下部鲜重均最大，分别较纯水对照显著(P<0.05)增加23.2%和24.4%。在100 mmol·L-1NaCl处理下，同样以施加混合藻液的小麦地上部和地下部鲜重最大，分别较纯水对照显著(P<0.05)增加23.6%和12.1%。在200 mmol·L-1NaCl处理下，施加混合藻液和衣藻藻液后，小麦地上部鲜重分别较纯水对照显著(P<0.05)增加了24.3%和12.2%，地下部鲜重分别较纯水对照显著(P<0.05)增加了27.1%和21.8%。以上结果表明，微藻可以缓释盐胁迫，促进小麦生长，从而提高小麦幼苗的鲜重。

图2 不同微藻处理对盐胁迫下对小麦地上部和地下部鲜质量的影响Fig.2 Effect of different microalgae treatments on fresh weight of aboveground and underground part of wheat under NaCl stress

2.3 微藻藻液对盐胁迫下小麦叶绿素含量的影响

如图3所示，当不添加NaCl时，施加3种藻液后，小麦幼苗的叶绿素a、b和总叶绿素含量相较于纯水对照组均有不同限度的提高，其中，以混合藻液的效果最好，叶绿素a、b和总叶绿素含量分别显著(P<0.05)提高20.3%、21.1%和20.5%。在50 mmol·L-1NaCl处理下，同样以混合藻液处理的小麦幼苗叶绿素a、b和总叶绿素含量最高，分别为9.4、3.5、12.9 mg·g-1。在100、200 mmol·L-1NaCl处理下，小麦生长受到抑制，小麦幼苗的叶绿素含量有所下降，但相较于纯水对照，施加3种藻液后小麦幼苗的叶绿素a、b和总叶绿素含量均有不同限度的提高。上述结果说明，施加微藻能够提高盐胁迫下小麦幼苗叶片的叶绿素含量，从而促进小麦生长。

图3 不同微藻处理对盐胁迫下小麦幼苗叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量的影响Fig.3 Effect of different microalgae treatments on contents of chlorophyll a， chlorophyll b and total chlorophyll of wheat under NaCl stress

2.4 微藻藻液对盐胁迫下小麦Fv/Fm值的影响

如图4所示，试验进行1 d时，在0、50 mmol·L-1NaCl处理下，小麦的Fv/Fm值较试验开始时(0 d)变化不明显，说明低浓度的NaCl对小麦的Fv/Fm值影响较小；但在100、200 mmol·L-1NaCl处理下，小麦的Fv/Fm值变化明显，尤其是在200 mmol·L-1NaCl处理下，小麦的Fv/Fm值变化最大，说明高浓度的NaCl对小麦的光合作用有明显抑制作用。试验进行至2～4 d时，在0、50 mmol·L-1NaCl处理下，小麦的Fv/Fm值不断下降，其中以纯水对照组下降最明显；而在100 mmol·L-1NaCl处理下，试验进行3 d后小麦的Fv/Fm值即趋于稳定；在200 mmol·L-1NaCl处理下，小麦的Fv/Fm值变化较小。试验进行4 d后，各NaCl浓度下小麦的Fv/Fm值的变化趋于稳定。

图a～d中的NaCl浓度分别为0、50、100、200 mmol·L-1。NaCl concentration in a-d was 0， 50， 100， 200 mmol·L-1， respectively.图4 不同微藻处理对盐胁迫下小麦Fv/Fm的影响Fig.4 Effect of different microalgae treatments on Fv/Fm of wheat under NaCl stress

2.5 微藻藻液对盐胁迫下小麦幼苗叶片抗氧化酶活性的影响

如图5所示，当不添加NaCl时，与纯水对照相比，施加混合藻液的小麦叶片CAT和POD活性显著(P<0.05)增加。随着NaCl浓度增加，纯水对照组的小麦叶片SOD活性逐渐增加，而施加混合藻液和衣藻藻液的小麦叶片SOD活性则是先增加后降低。在50 mmol·L-1NaCl处理下，相较于纯水对照，施加混合藻液和衣藻藻液显著(P<0.05)提高了小麦叶片的SOD活性；但在100、200 mmol·L-1NaCl处理下，施加3种藻液的小麦叶片SOD活性均较纯水对照显著(P<0.05)下降。在50、100 mmol·L-1NaCl处理下，施加3种藻液的小麦叶片CAT活性均较纯水对照显著(P<0.05)上升；但在200 mmol·L-1NaCl处理下，施加3种藻液的小麦叶片CAT活性却均较纯水对照显著(P<0.05)下降。在50 mmol·L-1NaCl处理下，相较于纯水对照，施加3种藻液均显著(P<0.05)提高了小麦叶片的POD活性；在100 mmol·L-1NaCl处理下，相较于纯水对照，施加混合藻液或衣藻藻液显著(P<0.05)提高了小麦叶片的POD活性；但在200 mmol·L-1NaCl处理下，相较于纯水对照，仅施加混合藻液显著(P<0.05)提高了小麦叶片的POD活性。

图5 不同微藻处理对盐胁迫下小麦幼苗叶片SOD、CAT和POD活性的影响Fig.5 Effects of different microalgae treatments on activities of SOD， CAT and POD in leaves of wheat seedlings under NaCl stress

3 讨论

3.1 微藻藻液对盐胁迫下小麦生长指标的影响

盐胁迫是影响植物生长的非生物胁迫因子之一，盐浓度超过植物耐受阈值时会出现植物生长发育受到抑制和光合作用效率下降等现象，严重时将造成植物死亡[14]。微藻可以分泌多种生物活性物质，如植物激素和胞外多糖等，这些物质能够促进植物生长，改善土壤质量，可以减缓盐胁迫对植物生长的抑制作用。

本研究结果表明，50 mmol·L-1的NaCl处理促进了小麦幼苗茎长和根长的生长，这与之前的研究结果一致[15]；但当NaCl浓度大于100 mmol·L-1时，小麦茎长和根长受到抑制。随着NaCl浓度增加，小麦地下部鲜重也逐渐下降。施加微藻可以缓解盐胁迫对小麦幼苗生长的抑制作用，藻液处理组的小麦茎长、根长和鲜重指标均高于对照组。这可能是因为，微藻分泌的胞外多糖中的低聚糖起到了缓冲作用。这类低聚糖具有类激素的活性，有助于调节植物的新陈代谢、生长和发育[16]。Cortés-Jiménez等[17]研究表明，盐胁迫下小球藻提取物增加了番茄根和茎的长度；El Arroussi等[18]研究发现，盐胁迫下杜氏盐藻胞外多糖处理显著提高了番茄植株的茎长、根长和干重；El Arroussi等[19]的研究表明，从螺旋藻中提取的多糖对辣椒和茄属植物的生长有显著的促进作用：这些研究均与本文的结果一致。在以后的研究中，还需要进一步验证其具体的影响机制。

3.2 微藻藻液对盐胁迫下小麦叶绿素含量和叶绿素荧光参数的影响

叶绿素是高等植物进行光合作用的主要成分，叶绿素的含量能够反映植物光合作用的水平，在某种程度上，叶绿素含量表征了植物的健康程度[20]。在盐胁迫条件下，植物细胞的叶绿体中将产生大量的活性氧，活性氧的氧化会导致叶绿体内蛋白质合成受阻，进而抑制光合作用[21]。

大量研究发现，盐胁迫条件下小麦幼苗叶片的叶绿素含量显著下降[18，22-23]。在本研究中，随着NaCl浓度增加，小麦叶片的叶绿素含量逐渐下降。施加微藻可以提高小麦叶片的叶绿素含量，尤其是混合藻液处理后，小麦叶片的叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量均达到最高。这可能是由于微藻分泌的胞外多糖可以通过促进抗氧化物酶的产生来降解植物叶绿体内的活性氧，从而抑制叶绿素的降解，进而提高小麦的叶绿素含量。

Fv/Fm通常反映PSⅡ反应中心的固有能量转换效率或PSⅡ的最大光能转换效率[24]，该参数对胁迫条件和环境(盐度、光强、温度、pH)变化敏感[25]，是反映植物受抑制程度的良好指标和探针[26]。因此，在盐胁迫条件下检测Fv/Fm能反映小麦受胁迫的程度和小麦的光合作用效率变化。本试验中，小麦在未受到盐胁迫时，其Fv/Fm值在0.8左右，并且以施加混合藻液处理的Fv/Fm值较高，说明此时小麦的光合作用未受到抑制，同时施加微藻能够提高小麦的光合作用效率。在盐胁迫条件下，小麦的Fv/Fm值下降，说明盐胁迫导致其光合作用速率降低，减少了同化物与能量的供给，不利于小麦的生长发育。盐胁迫条件下，施加微藻减缓了小麦的Fv/Fm值下降，表明微藻可以缓解NaCl胁迫对PSⅡ的损伤，维持PSⅡ的光化学活性和光合电子传递的进行，提高盐胁迫条件下小麦的光合作用效率。

3.3 微藻藻液对盐胁迫下小麦幼苗叶片抗氧化酶活性的影响

盐胁迫环境下，植物细胞会产生大量的活性氧(ROS)和自由基，对植物细胞结构，及蛋白质、脂质和核酸等生物大分子造成伤害，最终导致细胞损伤和死亡[27]。对于活性氧和自由基的清除，植物已经进化出高效的酶促和非酶促抗氧化系统，以保护其免受氧化损伤[28]。酶促抗氧化系统主要包括SOD、CAT和POD等，这些抗氧化酶位于植物细胞的不同部位，共同作用来清除ROS和自由基[29]。SOD是一种金属酶，作为第一道防线将超氧阴离子转化为H2O2和O2，CAT和POD主要是清除多余的活性氧和自由基，减少H2O2对植物造成的伤害[30]。

已有研究表明，微藻多糖可以通过提高抗氧化酶的活性来减轻植物体内ROS的毒性[31-32]。El Arroussi等[18]的研究表明，杜氏盐藻分泌的胞外多糖提高了植物在盐胁迫下CAT、POD和SOD的活性；Zou等[33]也证明，藻类多糖可通过调节小麦幼苗在盐胁迫下的抗氧化酶活性，诱导小麦幼苗的活性氧清除能力。本研究表明，无NaCl胁迫时，小麦叶片中的SOD、CAT和POD活性无明显变化。在盐胁迫下，未施加微藻时，随着NaCl浓度增加，小麦幼苗叶片中SOD、CAT和POD活性逐渐增加，这与之前研究结果一致[34]。施加微藻后，小麦叶片中的SOD活性先增加后降低，而CAT和POD活性增加后保持稳定。这可能是因为施加微藻增强了植物的渗透调节作用，增强了活性氧清除能力，缓解了盐胁迫。在未来的试验中，还需围绕其具体影响机制做进一步探讨。