生防菌株PF-1基于全基因组数据的分类鉴定及拮抗能力分析

戚家明，孙杉杉，张东旭，肖建中，徐志文

(1.领先生物农业股份有限公司，河北 秦皇岛 066004； 2.河北省农业生物技术创新中心，河北 秦皇岛 066004； 3.河北省农业农村厅 植物营养与海洋功能肥料重点实验室，河北 秦皇岛 066004； 4.丽水学院 生态学院，浙江 丽水 323000)

防御假单胞菌(Pseudomonasprotegens)是一种分布广泛的具有良好生防效果的革兰氏阴性细菌[1]。Ramette等[1]和Haas等[2]研究发现，原本属于荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)的CHA0和Pf-5等菌株能够同时产生藤黄绿菌素(pyoluteorin)和2，4-二乙酰基藤黄酚(2，4-diacetylphloroglucinol，2,4-DAPG)两种抗菌物质，相比于其他荧光假单胞菌具有良好的生物防治效果，能够抑制多种植物病原物生长，故这一类假单胞菌被重新分类为新种防御假单胞菌(Pseudomonasprotegens)。

防御假单胞菌是一类重要的植物根际促生菌，可以分泌多种具有广谱抗菌能力的活性物质，例如藤黄绿脓菌素(pyoluteorin)、吩嗪-1-羧酸(phenazine-1-carboxylic acid，PCA)、吡咯菌素(pyrrolnitrin)、2，4-二乙酰基滕黄酚(2，4-diacetylphloroglucinol，2,4-DAPG)和氰化氢(HCN)等，除抗菌物质外，防御假单胞菌还能分泌一些杀虫毒素，相比于其他假单胞菌具有更加突出的生物防治效果[2-3]。

利用全基因组序列信息可以对微生物进行准确的分类鉴定和生防潜力的快速挖掘。基于基因组水平的平均核苷酸一致性(average nucleotide identity，ANI)[4-6]分析和DNA同源性(DNA-DNA hybridization，DDH)[7]分析是常用的微生物分类鉴定方法。antiSMASH在线工具自发布以来，在挖掘次级代谢产物基因簇领域得到了广泛的应用，成为了应用最广泛的次级代谢产物合成基因簇的挖掘工具[8]。

本试验对本公司从土壤中分离到的一株具有良好生防效果的生防菌株PF-1进行研究，通过拮抗试验发现PF-1对病原真菌的生长具有良好的抑制效果，通过全基因组测序得到PF-1的全基因组信息，结合16S rRNA序列、平均核苷酸一致性(ANI)及DNA同源性(DDH)综合分析可以对生防菌株PF-1的分类地位进行准确鉴定，利用antiSMASH在线工具对PF-1的抑菌相关功能基因进行分析，探索其生防特性，为菌株PF-1的农业生产应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试菌株：生防菌株PF-1，该菌株为土壤中筛选到具有较好生防效果的根际微生物，由领先生物农业股份有限公司分离并保存。

植物病原真菌：马铃薯枯萎病菌(Fusariumoxysporum)、棉花黄萎病菌(VerticilliumdahliaeKleb)，由领先生物农业股份有限公司分离并保存。

主要培养基：LB培养基，蛋白胨10.0 g·L-1、酵母粉5.0 g·L-1、氯化钠10.0 g·L-1，pH 7；PDA培养基，马铃薯200.0 g·L-1、葡萄糖20.0 g·L-1。

1.2 方法

1.2.1 植物病原真菌拮抗试验

采用平板对峙法，首先在平皿中间分别放置马铃薯枯萎病菌(Fusariumoxysporum)和棉花黄萎病菌(VerticilliumdahliaeKleb)的菌丝块。然后在菌丝块两旁滴加10 μL PF-1的菌液，每种病原菌重复3次拮抗试验，设不接种PF-1的空白对照，于培养箱中20 ℃培养5 d。根据下列公式计算PF-1对植物病原菌的生长抑制率：抑制率(%)=[(对照菌落直径-处理菌落直径)/(对照菌落直径-菌饼直径)]×100%

1.2.2 生防菌株PF-1的全基因组测序

将PF-1接于LB液体培养基中，37 ℃、180 r·min-1培养至对数期，在4 ℃下4 500 r·min-1离心10 min，舍去上清液收集菌体，利用液氮冷冻保存送至北京诺禾致源科技股份有限公司(Beijing Novogene Bioinformatics Technology Co.， Ltd)进行全基因组测序，获得其全基因组序列，将PF-1的全基因组信息上传至NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)，获得登录号为VAVY00000000。

1.2.3 16S rRNA基因序列分析

根据全基因组注释信息，选择16S rRNA基因序列提交至ezbiocloud.net数据库进行比对分析，利用MEGA 7.0.26软件Neighbor-Joining 法构建系统发育树。

1.2.4 ANI和DDH分析

使用Jspecies(http://jspecies.ribohost.com/jspeciesws//)中的Mummer[9]对研究中的菌株全基因组进行平均核苷酸一致性(average nucleotide identity，ANI)值的计算。使用Genome-to-Genome Distance Calculation(http://ggdc.dsmz.de/distcalc2.php)[10]对研究中的菌株全基因组进行DDH值的计算。

1.2.5 次级代谢产物合成基因簇分析

本研究利用antiSMASH 3.0[11]bacterial version(https://antismash.secondarymetabolites.org/)对PF-1菌株中次生代谢物合成基因组簇进行预测。

2 结果与分析

2.1 植物病原真菌拮抗试验

拮抗试验结果如图1所示，PF-1对棉花黄萎病菌(VerticilliumdahliaeKleb.)和马铃薯枯萎病菌(Fusariumoxysporum)的生长均具有良好抑制效果，抑菌率分别为71.30%和68.79%。

A， 棉花黄萎病菌，接种PF-1；B，棉花黄萎病菌，不接种PF-1；C，马铃薯枯萎病菌，接种PF-1；D， 马铃薯枯萎病菌，不接种PF-1。A， Verticillium dahliae Kleb with strain PF-1; B， Verticillium dahliae Kleb without strain PF-1; C， Fusarium oxysporum with strain PF-1; D， Fusarium oxysporum with strain PF-1.图1 PF-1对棉花黄萎病菌和马铃薯枯萎病菌的抑制效果Fig.1 The plate isolate-antagonistic experiments of strain PF-1 with Verticillium dahliae Kleb and Fusarium oxysporum

2.2 菌株PF-1的分子生物学鉴定

2.2.1 基于16S rRNA 序列比对结果的系统进化分析

将全基因组数据注释到的PF-1的16S rRNA序列提交至ezbiocloud.net的数据库中进行比对，利用MEGA7软件的邻位连接法构建系统发育树(相似度重复计算1 000次)。生防菌株PF-1基于16S rRNA序列的系统发育树如图2所示。系统发育树结果显示，PF-1与PseudomonasprotegensPf-5及模式菌株PseudomonasprotegensCHA0聚为一类，可以确定PF-1为防御假单胞菌(Pseudomonasprotegens)。

括号中的序号为相关菌株GenBank的登录号；分支点上的数字表示Bootstrap支持率；线段0.0010表示序列差异的分支长度；上标T代表该菌株为模式菌株。下同。The numbers in parentheses represented the sequence accession numbers in GenBank. The numbers in each branch point indicated the rate of support by bootstrap. The scale bar showed the 0.0010 substitution value on each nucleotide site. Superscript T represented the type strain. The same as below.图2 基于16S rRNA序列比对结果构建的菌株PF-1的系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree of the strain PF-1 based on 16S rRNA sequence

2.2.2 ANI和DDH分析

选择在16S rRNA序列比对中的具有全基因组序列数据的菌株与PF-1进行ANI及DDH分析。该11株假单胞菌的ANI值和DDH值结果如表1所示，其中PF-1与PseudomonasprotegensPf-5和PseudomonasprotegensCHA0的ANI值分别为99.99%和98.87%，根据网站给出的95%的种间鉴定标准，菌株PF-1与Pf-5和CHA0为同种，其中PF-1与Pf-5的相似度最高。PF-1与PseudomonasprotegensPf-5和PseudomonasprotegensCHA0的DDH值分别为99.1%和89.6%，根据网站给出的70%的种间鉴定标准，菌株PF-1与Pf-5和CHA0为同种，其中PF-1与Pf-5的相似度最高，与ANI分析结果一致。

表1 PF-1及其近缘菌种平均核苷酸一致性(ANI)和DNA同源性分析(DDH)数值Table 1 ANI and DDH analysis between PF1 and relative strains

2.2.3PseudomonasprotegensPF-1次级代谢产物合成基因簇分析

将PseudomonasprotegensPF-1的基因组序列上传至antiSMASH中进行次级代谢产物合成基因簇挖掘，同时对2.2.2节中参与分类的假单胞菌株进行次级代谢产物合成基因簇分析，基因簇统计结果如表2所示。P.protegensPF-1具有最多的15个与次级代谢产物合成相关的基因簇。

表2 PF-1及其近缘菌种基因组中次级代谢产物合成基因簇数量统计Table 2 Statistics of secondary metabolite gene clusters in PF-1 and other Pseudomonas genomes

P.protegensPF-1与亲缘关系较近的P.protegensPf-5和P.protegensCHA0具有类似的次级代谢产物合成基因簇构成。与已知功能的次级代谢产物合成基因簇比对，P.protegensPF-1中具有5个相似度超过50%的次级代谢产物合成基因簇，且均具有抗菌作用。

3 讨论

植物病害是威胁农业生产的重要因素之一，目前主要依赖化学农药对植物病害进行防治，然而化学农药的长期大量使用导致农药残留及环境污染问题日益严重，同时也使病原菌产生了严重的抗药性。因此，研究其他绿色安全的防治方法已刻不容缓[12-13]。近年来绿色高效的生物防治作为防治植物病害的重要手段逐渐受到研究人员的关注。目前，应用较多的生防细菌主要有假单胞杆菌(Pseudanonas)、芽孢杆菌(Bacillus)、土壤放射杆菌(Agrobacteriumradiobacter)、沙雷氏菌(Serratia)和巴氏杆菌(Pasteurella)等，其中针对假单胞菌和芽孢杆菌的研究最多[14-15]。

PF-1是作者所在研究团队从植物根际土壤中分离到的一株具有良好应用效果的生防菌株，为明确其分类地位及分析挖掘其生防潜力，本研究对PF-1进行了全基因组测序，结合相关软件分析确定了PF-1的分类地位并对其抗病防病能力进行了分析。

16S rRNA基因是细菌系统发育和种属鉴定的常用分类工具，但自身也存在一定的局限性，在基因组水平上，DNA同源性分析(DDH)是用于区分原核生物种属的重要指标，当DDH值大于70%时可以被认为属于同一种[16]，平均核苷酸一致性分析(ANI)是对两个基因组间同源基因的相似性进行分析来评估物种间的亲缘关系远近，ANI值达到95%以上的菌株被认为是同一个种[17]。在本研究中结合PF-1的16S rRNA基因序列、平均核苷酸一致性(ANI)分析及DNA同源性(DDH)分析，可以准确将PF-1鉴定为防御假单胞菌。

antiSMASH是一种能够较完整的挖掘细菌和真菌基因组中次生代谢产物基因簇的在线工具，在挖掘次级代谢产物合成基因领域得到了广泛的应用[8]。本研究中将与PF-1亲缘关系较近的几株假单胞菌的基因组提交至antiSMASH进行分析，PF-1具有最多的15种与抑菌物质合成相关的基因簇，其中包括藤黄绿脓菌素、硝吡咯菌素、Orfamide和2，4-二乙酰基藤黄酚等重要抑菌物质的合成基因簇。

藤黄绿脓菌素(pyoluteorin)是一种芳香族聚酮类抗生素，对多种细菌和真菌的生长具有抑制作用，其对卵菌纲的病原菌的抑制性最强[18-20]，藤黄绿脓菌素可以直接作用于病原菌，或形成一个不利于病原菌的环境条件从而间接抑制病原菌的生长[21]。有研究表明其对棉花立枯病[22]和由腐霉引起的水芹腐烂病[18]等病害具有较好的防治效果。

硝吡咯菌素(pyrrolnitrin)是色氨酸衍生的有机卤代次级代谢物[23]，可以影响能量依赖的生理代谢过程，从而抑制DNA、RNA和蛋白质的合成，减少病原微生物对氨基酸、胸腺嘧啶及尿嘧啶的吸收[24]。硝吡咯菌素对多种植物病害具有防治作用，例如由立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)、灰葡萄孢(Botrytiscinerea)引起的病害等，硝吡咯菌素衍生物苯吡咯已经被开发为农业杀菌剂[25，26]。

Orfamide是一种环脂肽类抗菌物质，其对疫霉属(Phytophthora)和腐霉属(Pythium)病原菌的游动孢子具有抑制活性，对立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)具有抑制生长的作用[27-28]，同时Orfamide也具有杀虫活性[29]。除抑菌活性外，Orfamide还是一种植物系统诱导抗病性(induced systemic resistance，ISR)的激发子，提高植物自身对病原物的抗性从而减少病害的发生[30]。

2，4-二乙酰基藤黄酚(2，4-DAPG)属于酚类抗生素，具有广谱的抗真菌、细菌及杀蠕虫活性，还具有除草活性[31]。其对番茄青枯病[32]、花生茎腐病[33]及许多豌豆病害[34]具有良好的防治效果。2，4-DAPG也是一种植物系统诱导抗病性的激发子，可以诱导拟南芥对活体营养型卵菌(Hyaloperonosporaarabidopsidis)[35]和丁香假单胞菌番茄专化型(Pseudomonassyringaepv. tomato)[36]的抗性。

防御假单胞菌PF-1具有种类丰富的次生代谢产物基因簇，具有多样的生防机理。次生代谢产物不仅对多种病原细菌和病原真菌的生长具有直接抑制生长的能力，除此之外部分代谢产物同时还是植物诱导系统抗性(ISR)的激发子，例如Orfamide和2，4-DAPG。诱导系统抗性是由非病原性细菌分泌的物质引起的植物体内系统性抗性从而提高植物整体的抗病能力。除5种已知功能的次生代谢产物基因簇外，防御假单胞菌PF-1还有10种与已知功能的次生代谢产物基因簇相似度较低和5种未知功能的次生代谢产物基因簇，这表明PF-1具有较大的应用潜力有待开发。

4 结论

本研究对具有良好生防效果的菌株PF-1进行全基因组测序得到了其基因组序列，通过对PF-1的16S rRNA基因、平均核苷酸一致性分析及DNA同源性分析可以准确地将PF-1鉴定为防御假单胞菌。通过antiSMASH在线工具对PF-1中次生代谢产物基因簇进行分析，共发现15个相关基因簇，次生代谢产物基因簇种类丰富，生防机理多样，具有较强的抑制病原微生物生长和提高植物自身抗性的功能。本研究通过基因组分析发现防御假单胞菌PF-1具有较强的应用潜力，为其在防病增产方面的应用提供了理论依据。