天麻染色体有丝分裂期标本的制备方法

杨通静，桂 阳，黄万兵，朱国胜

（贵州省农作物品种资源研究所,贵州贵阳 550006）

我国栽培的天麻主要有红天麻、乌天麻、绿天麻，均为天麻变种[1]。天麻的研究主要集中在分类[1]、栽培[2]、化学成分[3-4]、药效[5-6]等方面。染色体是生物细胞核中最重要而稳定的成分，它具有特定的形态结构和一定的数目，具有自我复制能力，并积极参与细胞的代谢活动，是决定物种繁衍的遗传物质的载体。天麻遗传学方面的研究较少，梁汉兴[7]、王德信[8]等以花粉小孢子为材料，观察减数分裂不同时期染色体特征，鉴定出天麻单倍体的染色体数目，但天麻有丝分裂染色体特征不能较好的呈现，也无法鉴定天麻的倍性。植物染色体制片和核型分析技术是细胞遗传学中最基本、最常用的方法，在物种亲缘关系鉴定、染色体变异、杂种分析等方面得到广泛应用。其中，去壁、低渗法是植物染色体制片和核型分析技术最为常用的方法，在染色体计数、组型分析、Giemsa分带、扫描电镜观察染色体方面均得到大量的应用[9]。其主要特点在于利用纤维素酶、果胶酶混合液对细胞壁进行分解后，增加低渗环节，使细胞膜在低渗条件下扩张的同时，促使染色体更加分散。但是，天麻的细胞内存在大量的内涵物质，特别是块茎材料中存在大量的淀粉，为了有效观察天麻染色体特征，以及前期的工作，笔者拟利用天麻柱头结合低渗制片法，通过增加低渗环节，使解离后的细胞在低渗透压下充分扩张，使染色体充分分散，建立一种天麻染色体有丝分裂中期的制片方法，以期观察天麻染色体结构特征。

1 材料与方法

1.1 材料

材料为纯化4代以上的乌天麻，源于贵州省农作物品种资源研究所真菌室课题组。

1.2 方法

1.2.1 材料培养方法

将箭麻（鹦哥嘴完整无损伤）块茎埋于湿度在40%-50%沙土中，让其自然状态下抽薹，开花当天及开花前5天的天麻花柱头。

1.2.2 染色剂的配制

吉姆萨（Giemsa）染色试剂的配制 吉姆萨0.6g，甘油 50ml，甲醇100ml；将吉姆萨染粉溶于甘油内，在研钵内研磨3-4h，使之磨匀，加入纯甲醇后搅拌均匀，放入深棕色瓶内，室温下保存，2周后即可使用。

改良石炭酸品红染色剂的配制 1）原液A：称取3g碱性品红（Basicfuchsin）溶于100ml 70%乙醇中（可永久保存）；2）原液B：取10ml 原液A加入90m15%的苯酚水溶液，在37 ℃条件下温育2-4h（该溶液不稳定，应在2周内使用）；3）原液C：取55ml原液B加入6ml 冰乙酸和6ml 甲醛，充分混匀；4）卡宝品红染液：取10-20ml 原液C加入约80ml 45%的冰乙酸和1g山梨醇（可永久保存）。

1.2.3 镜检

选取分散良好、染色体完整、边缘清晰的染色体不同分裂相，在10 x 100倍镜下观察染色形态结构，显微照相。

2 标本制备方法的筛选

2.1 纺锤丝阻断剂的选择

通过对常用的纺锤丝阻断剂秋水仙素和8-羟基喹啉在不同浓度和处理时间进行筛选，见表1及表2。8-羟基喹啉1h处理后的图片见图1。

表1 秋水仙素不同时间染色体有丝分裂中期细胞数多少对比表

表2 8-羟基喹啉不同时间染色体有丝分裂中期细胞数多少对比表

2.2 解离试剂的筛选

天麻制片过程中，解离尤为重要，是制片的关键，解离效果不好，细胞软化不够，天麻组织挤压不开，细胞分散不开和重叠，染色体分散不开，不易观察染色体数目和特征。通过对混合酶（纤维素酶、果胶酶）在28oC恒温处理，HCL60oC恒温处理不同时间对比，见表3及表4。HCL 60oC解离5min处理图片见图2，探索最佳处理方法。

表3 不同浓度的混合酶不同时间处理效果对比表

表4 不同浓度的HCL不同时间处理效果对比表

2.3 染色剂的选择和染色时间的确定

染色体制片过程中，染色体着色深浅是制片的关键，通过对吉姆萨（Giemsa）染色试剂和改良石炭酸品红通用浓度下不同时间染色观察，筛选最佳染色时间，见表5。不同染色剂染色效果图片见图3。

图1 8-羟基喹啉1h处理后的图片

图2 1.0M HCL 60oC解离5min处理图

图3 不同染色剂染色效果图

表5 不同染色效果比较

3 结果

3.1 阻断剂筛选

在试剂筛选过程中，发现浓度在0.002%-0.004%的8-羟基喹啉（8-Hydroxyquinoline）处理50min效果较佳，处于细胞中期的染色体浓缩度大，易于观察。天麻染色体标本制备过程中，秋水仙素在1.5h后其阻断效果较好。

3.2 解离剂筛选

天麻制片过程中，解离尤为重要，是制片的关键，解离效果不好，细胞软化不够，天麻组织挤压不开，染色体分散不开，经对比发现，天麻组织中细胞壁的软化和解离通过1M HCL60oC恒温5min，效果可以达到最佳。

3.3 染色剂筛选

Giemsa和改良石炭酸品红染色效果对比发现，天麻标本制作过程中，Giemsa着色浅，不能较好的将染色体着色，改良石炭酸品红染色30min后，通过图片处理软件可使图片达到核型分析要求，50min后最佳，看到较为清晰的染色体，随着时间延长，背景着色随之加深。

3.4 制片方法的确定

通过对阻断剂、解离手段和染色剂的筛选，结合去壁、低渗方法，最终确定天麻染色体的制片流程为：取材（柱头）——预处理——固定——前低渗——解离——后低渗——固定——染色50min——压片——镜检。

1）取材。柱头取材：自然条件下（上午9：00-11：00），开花前5天内，取柱头；原球茎取材：上午9：00-11：00，取2-3mm左右的原球茎；生长点分生组织取材：上午9：00-11：00取新生长子（白）麻前端组织。

2）预处理。将材料置于0.003%/L 8-羟基喹啉中，室温处理50min左右，取出用蒸馏水漂洗2-3次。

3）固定。然后用新配的卡诺固定液进行固定，时间为1h。

4）前低渗。柱头用蒸馏水洗3次，加入0.75mol/L KCL作前低渗30min。

5）解离。前低渗后的柱头用蒸馏水漂洗2-3次，加入1M盐酸，60oC水浴，5min解离。

6）后低渗。将解离后的柱头用蒸馏水漂洗2-3次，最后1次浸蒸馏水30min作后低渗。

7）固定。吸去蒸馏水，加入新配卡诺固定液（冰醋酸∶甲醇＝1∶3）固定1h。

8）染色。将固定后的材料（组培材料取茎尖0.2cm）置于干净载玻片上，加改良后的卡宝品红染液1-2滴，染色50min。

9）制片。用45%的冰醋酸洗1-2次，取干净的盖玻片盖在材料上，先用铅笔头或者镊子轻轻敲打，再用拇指压片。

10）镜检 制备好后的标本在显微镜下观察，对分裂相好的细胞进行观察、拍照。

4 讨论与分析

通过本文中的方法，可以较好的制备出天麻染色体有丝分裂期标本。从图4中A-E可以看出，可以清晰的观察到天麻染色体有丝分裂过程结构变化，从间期的细胞核的体积增大，染色质和细染色体螺旋缠绕并逐渐缩短变粗形成染色体，核膜破裂后染色体分散于细胞质中。由于极微管和着丝微管之间的相互作用，染色体向赤道面运动。最后在纺锤体的作用下向两级迁移，最后细胞膜已经形成，形成两个独立细胞过程。

8-羟基喹啉和秋水仙素均抑制有丝分裂的这一特性，使其成为研究细胞染色体的常用工具药。是染色体分析实验中的关键步骤，在风信子、马铃薯和人类外周血淋巴细胞方面的染色体研究中都有应用。在筛选对比实验中，8-羟基喹啉只需要50min就可以达到效果，而秋水仙素则需要1.5h才能达到最佳效果，相对来说，秋水仙素在诱变育种中应较多，而8-羟基喹啉在细胞染色体研究中应用较多[10-13]。

低渗的目的在于使细胞吸收水分而膨胀，染色体分散到细胞质中，在制片时便于染色体分散开，这一方法可以应用到天麻染色体有丝分裂的标本制备中去。去壁、低渗法在37个科105种植物中进行过应用[9]，均取得较好的效果。天麻也适合这一方法。

天麻染色体有丝分裂标本制备过程中，使用混合酶液（果胶酶+纤维素酶）去除细胞壁在天麻柱头这一材料中效果并不理想，而用1M盐酸60oC水浴5min解离效果更佳。细胞组织分散不开，不能获得较为理想的图片。即使延长了后低渗的时间，效果液也并不理想[9]。这可能与水浴设备或者温控设备有关系。

图4 天麻染色体有丝分裂不同时期表本图

同时，笔者在前期工作中发现天麻开花后随着时间的推移，其柱头表面粘性逐渐减弱，组织结构逐渐变硬，导致制备染色体有丝分裂中期标本过程中解离难度增加。前期的工作中发现，开花3天后的柱头很难获得分散较好的细胞标本。这可能是柱头暴露在空气中后，水分挥发导致其组织结构收缩变硬，粘性减弱，柱头组织恢复难度大的原因所导致。