虎儿金植物有机硒、无机硒及Vc体外抗氧化活性研究

谢娟平, 靳文娟, 张佳莹

(安康学院 医学院 秦巴中药资源研发中心,陕西 安康 725000)

硒是动物和人体中硒-P蛋白和抗氧化酶(谷胱甘肽过氧化物酶)的重要组成部分和活性中心，是GSH-Px中起氧化还原催化作用的仅有原子，能阻止和抑制自由基反应和脂质过氧化反应，被称为“天然解毒剂”[1-3]。适量补充硒有提高免疫力，延缓衰老，防癌抗癌的重要作用。维生素C是一种强抗氧化物质，可抵御自由基对细胞的伤害，进而抵御器官伤害，保护机体功能，维生素C常被用做参照物质来评判抗氧化能力。虎儿金是秦巴山区的特有超富硒植物资源资源之一，对土壤中的硒具有极强的富集作用，经植物自身转化，其全植物有机硒含量较高，是近年富硒植物研究的热点之一。研究表明，来自于植物的有机硒更有利于人体吸收，具有较强的抗氧化活性，能更好的起到防病抗病的作用[1][4～7]，但虎儿金植物有机硒在抗氧化活性方面是否与无机硒及维生素C存在差异，还未见文献报道。因此，测定与比较虎儿金植物有机硒、无机硒及Vc的体外抗氧化活性具有重要的意义[8～9]。

研究采用1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)法，以VC为对照，对虎儿金植物有机硒、无机硒(硒标准溶液)及VC进行清除DPPH 自由基的活性研究，评价其抗氧化活性，以期为虎儿金植物有机硒抗氧化能力评价及相关产品开发提供实验依据[11～12]。

1 实验材料与仪器

DPPH(1，1-二苯基-2-三硝基苯肼)，Sigma公司；甲醇、乙醇均为分析纯，天津百世化工；BS224S型分析天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)；SY2200-T型超声波清洗机(上海声源超声波仪器设备有限公司)；PF6-2非色散原子荧光分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)；101-2B型电热鼓风干燥箱(天津市泰斯特仪器有限公司)；ML1.8-4型可调式电热板(北京化玻医疗器械有限公司)；FW80型高速万能试样粉碎机(北京科伟永兴仪器有限公司)；SZ-97自动三重水蒸馏气(上海亚荣生化仪器厂)；硝酸，高氯酸，盐酸，硼氢化钾，氢氧化钾，铁氰化钾，均为分析纯；水为三重蒸馏水，氩气，纯度为99.99%。

虎儿金植物有机硒(本课题组自制，超富硒植物虎儿金中提取，氢化物发生--原子荧光光谱法测定其硒含量为75 mg·kg-1)；无机硒(硒单元素标准溶液100.0 μg·mL-1，核工业化工研究所)，维生素C标准品(VC，上海沪峰化工有限公司)。

2 实验原理与方法

2.1 原理

DPPH (1，1-二苯基-2-三硝基苯肼)法是筛选自由基清除剂的简便方法。由于DPPH自由基具有单电子，其甲醇溶液呈深紫色，在516 nm 处的强吸收与浓度呈线性关系。当遇到抗氧化剂时，配对后溶液颜色变浅，吸光度变化与清除DPPH能力线性相关，可用于抗氧化能力的定量分析和判定。

2.2 方法

2.2.1 溶液配制 DPPH溶液配制：精密称取1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)约2.5 mg，甲醇溶解并定容至100 mL，置于棕色容量瓶中避光保存，备用。

硒单元素溶液配制：精密取浓度为100 μg·mL-1的硒标准溶液，用5%盐酸稀释，得2.0 μg·L-1的无机硒供试品溶液。

虎儿金植物有机硒溶液配制：准确称取超富硒植物虎儿金中提取的植物有机硒样品约3.7 mg，甲醇定容至100 mL，得浓度为2.775 ×10-6mg·mL-1的植物有机硒溶液。

维生素C(抗坏血酸)溶液配制：精密称取维生素C(抗坏血酸)约2.5 mg，甲醇溶解并定容至100 m，得浓度为0.025 mg·mL-1的VC溶液，备用。

2.2.2 DPPH自由基的清除实验 分别吸取0.05 mL、0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL浓度为2.0 μg·L-1无机硒溶液，置于10 mL离心管中，各管依次加入0.025 mg·mL-1DPPH甲醇溶液4 mL，甲醇定容至5 mL，室温下静置1小时，516 nm处测定吸光度，同法做空白对照。上述操作均于避光条件进行。按以下公式计算清除率：

式中A0为DPPH空白溶液的吸光度；At为t时刻溶液中DPPH自由基吸光度。

2.3 半数有效浓度EC50和清除能力

根据虎儿金植物有机硒、无机硒及Vc清除DPPH 自由基曲线计算EC50，得到清除50% DPPH 自由基时各样品与DPPH 的质量之比(mg·mg-1)，EC50值越小，清除自由基能力越强[5]，由EC50值大小对各样品抗氧化能力大小进行判断与比较。

3 结果与分析

3.1 DPPH自由基清除率

实验测定了虎儿金植物有机硒、无机硒和维生素C对DPPH自由基的清除率，以样品与DPPH的质量比(mg·mg-1)为横坐标，以对DPPH自由基清除率为纵坐标作图，结果见图1、图2和图3。

从图1、图2 和图3 可以看出，根据虎儿金植物有机硒、无机硒和维生素C对DPPH 自由基有明显清除作用，均有较强的抗氧化能力，且随着虎儿金植物有机硒、无机硒和维生素C样品量的增加，对DPPH 自由基清除能力增强。可以看出，在实验范围内，随着加入量的增加，清除能力起初增加迅速，但无机硒在质量比达到1.2×10-5mg·mg-1时清除率达到最大，此后趋于稳定；维生素C在质量比达到1.4×10-1mg·mg-1时趋于稳定，之后保持平衡。

3.2 自由基清除能力评价

从图1、图2 和图3 的虎儿金植物有机硒、无机硒和维生素C对DPPH 自由基清除拟合曲线上求出EC50值，结果见表1。

表1 虎儿金植物有机硒、无机硒和维生素C的EC50

由图1～3和表1可以看出，在DPPH自由基反应体系里，虎儿金植物有机硒、无机硒和维生素C对DPPH 自由基清除能力有明显的差异，虎儿金植物有机硒及无机硒的EC50值仅大约是维生素C的1/(3.57×103)，即虎儿金植物有机硒和无机硒抗氧化能力几乎是维生素C的2.8×104倍，表明虎儿金植物有机硒可作强效抗氧化剂，发挥对人体健康的保护作用。

3.3 反应时间对DPPH自由基清除的影响

实验研究了不同反应时间下虎儿金植物有机硒、无机硒和维生素C对自由基清除能力的变化。分别选取0.05 mL、0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL的各样品溶液，加入2.2.2项下相同量的DPPH溶液，分别于5 min、10 min、30 min、60 min、90 min时测定各样品对DPPH自由基的清除率。以反应时间为横坐标，以DPPH自由基清除率为纵坐标作图，结果如图4～6。可以看出，反应时间对虎儿金植物有机硒、无机硒和维生素C清除DPPH自由基影响很大，随着反应时间的增加，清除率逐渐增大，30 min至60 min清除率逐渐达到最大，60 min后清除率趋于稳定。

可以看出，不同反应时间下，虎儿金植物有机硒、无机硒和维生素C对DPPH自由基清除率不同，60 min左右各物质对DPPH清除率最大，其中虎儿金植物有机硒和VC对DPPH清除率最大可达95.72%，无机硒对DPPH自由基清除率最大达93.42%，之后趋于稳定。

4 讨论

笔者研究采用DPPH法测定了虎儿金植物有机硒、无机硒及维生素C对 DPPH自由基清除能力及反应时间对清除能力的影响。结果表明，虎儿金植物有机硒、无机硒及维生素C均具有较强的清除DPPH自由基能力，且随着各物质加入量的增加而增强，最终趋于稳定。从EC50值来看，虎儿金植物有机硒、无机硒对自由基清除能力远远高于维生素C。

可以看出，虎儿金植物有机硒的抗氧化能力更强于无机硒，但有机硒因来源于植物，经植物自身成长过程中的转化，更有利于人体吸收，可望在抗氧化、清除有害自由基保护人体健康方面发挥更大的作用，实验探索结果可对虎儿金植物有机硒开发应用提供一定参考。