壳聚糖螯合锌对大肠杆菌攻毒断奶大鼠回肠菌群结构及代谢产物的影响

冯丹，张民扬，田时祎，汪晶

(国家动物消化道营养国际联合研究中心，南京农业大学动物科技学院，江苏 南京 210095)

动物肠道内寄居着大量的微生物，这些复杂而庞大的微生物群落对宿主的健康起到非常重要的作用[1]，如塑造上皮细胞[2]，提供能量[3]，预防病原菌感染[4]以及调节免疫[5]等，然而这些过程可能会被肠道微生物组成变化所改变。动物断奶时由于受到应激的影响，并且肠道微生物区系的稳态也尚未形成，因此容易被外源肠道病原菌如大肠杆菌等入侵，引起肠道疾病甚至死亡。研究指出，日粮是影响肠道微生物菌群结构和功能的重要因素之一[6-7]。因此，通过日粮策略调控肠道菌群结构是促进宿主健康的一种有效手段。

以壳聚糖和无机锌盐为原料制备的螯合物壳聚糖螯合锌(CS-Zn)是本课题组前期研制的一种新型锌制剂。壳聚糖具有良好的生物相容性和生物降解活性，被广泛应用于医学、化工、食品等领域[8]。诸多研究表明，不同锌源降低断奶仔猪腹泻可能是通过调控肠道微生物菌群丰度和多样性来实现的。另有研究发现壳聚糖螯合锌减低肠道内容物中大肠杆菌、沙门菌数量，提高了乳酸杆菌的数量。然而关于壳聚糖对炎症机体的肠道微生物多样性和丰度的调控机制知之甚少。虽然大肠中细菌含量远远高于小肠，但小肠是肠道和日粮之间的第一个接触点，在进入大肠之前许多微生物定植在回肠，并且主要在回肠发酵[9]。因此，本试验采用16S rRNA高通量技术手段分析壳聚糖螯合锌对回肠菌群结构的影响，探讨壳聚糖螯合锌通过调节肠道菌群对机体肠道健康产生有益作用的可能机制。

1 材料与方法

1.1 试验材料

无特定病原(SPF)断奶Sprague-Dawley(SD)大鼠，初始体重(55.65±0.28)g，购自南京市江宁区青龙山动物繁育场，正式试验前适应3 d。壳聚糖螯合锌(CS-Zn)，由本课题组前期研制，锌含量为7.77%。七水合硫酸锌(ZnSO47H2O)为分析纯，锌含量为22.74%。大肠杆菌O157来自南京农业大学动物医学院惠赠。菌种在液体LB(Luria-Bertani)培养基中摇床220 r/min，37 ℃震荡培养12 h复苏大肠杆菌，取菌液在麦康凯选择培养基上划线，并于37 ℃培养箱培养18 h左右，挑取单个菌落进行培养。培养完成后的大肠杆菌菌液于4 000 r/min 离心10 min，然后将菌液用无菌PBS重悬至2.5×109CFU/mL，每只大鼠每天灌胃4 mL，每次灌胃2 mL，于4 h内全部灌完。

1.2 试验设计

24只断奶大鼠随机分为对照组和试验组，对照组饲喂基础日粮(AIN-93G，由青龙山动物繁育公司提供)；试验组饲喂基础日粮+640 mg/kg壳聚糖螯合锌(含锌50 mg/kg)。试验持续时间为14 d，在第10 d，所有大鼠每天灌胃总数为1010CFU/只大鼠的大肠杆菌菌液，连续灌胃3 d。饲喂在温度为22～25℃，相对湿度为55%～70%的标准环境中，12 h昼夜循环(8:00—20:00)循环，饲养标准动物饲料，自由采食和饮水，保持卫生环境。动物试验经南京农业大学试验动物伦理委员会批准。

1.3 样品采集

试验结束当天，处死实验大鼠，用手术刀将大鼠在无菌状态下解剖，分离回肠，将肠段中的内容物(微生物)收集到无菌的冻存管中，并迅速置于液氮中保存，以备后续分析。

1.4 测定指标

1.4.1 回肠食糜DNA提取与PCR扩增

参考Wang等[10]的方法，按照CTAB法提取回肠食糜总DNA。取0.3 g食糜样品，加入CTAB破壁细胞，使用酚-氯仿-异戊醇抽提DNA，再用冰乙醇去除杂质，最后加入TE buffer溶解DNA。完成微生物DNA抽提后，将样品进行高通量测序。以稀释后的基因组DNA为模板，使用带Barcode的特异引物(319F:ACTCCTACGGGAGGCAGCA，806R：GGACTACHVGGGTWTCTAAT)对提取出的回肠食糜微生物DNA的16S rRNA的V3-V4区进行PCR扩增，扩增后的产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，最后，使用Illumina PE250平台进行Miseq文库构建及上机测序，测序由上海美吉生物医药科技有限公司完成。

1.4.2 生物信息学分析

使用 Cutadapt(V1.9.1,http://cutadapt.readthedocs.io/en/stable/)[11]减去低质量Reads，截去Barcode和引物序列初步质控后即可得到原始数据(Raw Reads)。将获得的Raw Reads序列通过UCHIME Algorithm与物种注释数据库比对嵌合体序列，得到有效数据(Clean Reads)。再使用Uparse软件(V7.0.1001，http://www.drive5.com/uparse/)[12]对所有样品的Clean Reads按照97%的一致性聚类成OTUs(Operational Taxonomic Units)，随后进行物种注释。使用Mothur方法与SILVA123(http://www.arb-silva.de/)数据库在阈值为0.8～1范围内进行物种注释分析，获得各级别的分类学信息。使用R软件(V3.5.3,https://www.r-project.org/)的R包(vegan)计算微生物α多样性Shannon和Simpson指数。使用vegen包计算bray-curtis距离矩阵，并基于bray-curtis 距离矩阵，使用ggplot2包绘制主坐标分析(PCoA,principal coordinate analysis)图。门水平和属水平的差异使用Execl 2016、SPSS 22.0和GraphPad Prism 7.0统计计算并作图。最后，使用R包Tax4Fun基于16S物种丰度预测细菌群落代谢功能，并使用STAMP软件(V2.1.3,http://kiwi.cs.dal.ca/Software/STAMP)[13]对KEGG level2水平上的通路进行统计作图。所有原始序列数据均已上传至NCBI的SRA数据库，登录号：PRJNA624221。使用R包Hmisc和corrplot包进行皮尔森相关性分析并作图。

1.4.3 回肠食糜短链脂肪酸和乳酸含量的测定

使用气相色谱法测定回肠食糜短链脂肪酸(short-chain fatty acids,SCFAs)的浓度。首先称取约0.3 g食糜样品，置于2 mL离心管中，加入1.2 mL双蒸水，充分混匀后，10 000 r/min离心10 min，取上清0.8 mL于新的离心管中，加入0.16 mL 25%偏磷酸巴豆酸混合溶液，-20 ℃保存过夜。测定前解冻，4 ℃，12 000 r/min，离心10 min。吸取上清通过0.22 μm微孔滤膜过滤后待测。参照Wang等[10]的方法设置气相色谱条件：毛细吸管柱(柱长为30 m，内径为0.32 mm，膜厚为0.25 μm，Sigma-Aldrich，美国)，柱温135 ℃，进样口温度200 ℃，采用氢火焰离子检测器，检测温度200 ℃，载气为氢气，压力为60 kPa，氧气压力为50 kPa。严格按照乳酸试剂盒(南京建成生物工程研究所)说明书对回肠内容物中乳酸的含量进行测定。

1.5 数据统计

试验数据利用Excel 2016整理计算，使用SPSS 22.0统计软件先对数据进行Kolmogorov-Smirnov检验，当数据符合正态分布时，进行独立样本T检验；当数据不符合正态分布时，采用两个独立样本Mann-Whitney U检验。用Excel 2016、GraphPadPrism 7和R语言将得到的数理统计结果分别制作成图表。试验数据以平均值和标准差表示，P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著，0.05

2 结果与分析

2.1 壳聚糖螯合锌对大肠杆菌攻毒大鼠回肠食糜微生物多样性的影响

由表1得知，对照组和试验组回肠微生物OTU覆盖率大于0.99，能够覆盖回肠微生物绝大部分的物种，且试验组大鼠Simpson指数和Shannon指数均显著的低于对照组(P<0.05)，表明日粮添加壳聚糖螯合锌可以显著降低大肠杆菌攻毒大鼠回肠微生物α多样性。如图2所示，即回肠微生物β多样性结果，基于OTU水平的PCoA分析结果显示试验组与对照组微生物显著分开。

表1 壳聚糖螯合锌对大肠杆菌攻毒大鼠回肠微生物α多样性的影响

图1 壳聚糖螯合锌对大肠杆菌攻毒大鼠回肠微生物β多样性的影响

2.2 壳聚糖螯合锌对大肠杆菌攻毒大鼠回肠食糜微生物菌群结构的影响

如图2A所示，根据各组样品在门水平的分布显示回肠微生物优势菌门为厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门和放线菌门。对回肠微生物门水平的丰度统计分析发现(图2B)，试验组大鼠厚壁菌门相对丰度极显著高于对照组(P<0.01)，拟杆菌门、变形菌门和疣微菌门的相对丰度显著低于对照组(P<0.05)。表2所示为回肠食糜微生物属水平丰度排名前20的菌属。从图中可以看出试验组大鼠回肠Romboutsia属和苏黎世杆菌属(Turicibacter)相对丰度显著高于对照组(P<0.05)，而狭义梭菌属(Clostridiumsensustricto)和脱硫弧菌属(Desulfovibrio)丰度显著低于对照组(P<0.05)。

表2 壳聚糖螯合锌对大肠杆菌攻毒大鼠回肠微生物属水平的影响

2.3 壳聚糖螯合锌对大肠杆菌攻毒大鼠回肠食糜微生物Tax4Fun基因功能预测分析

基于16S的测序数据使用Tax4Fun对肠道微生物基因的功能进行预测，根据KO编号和KEGG数据库对应预测各层级代谢通路丰度，图3即为回肠微生物预测在KEGG第二层级水平上有显著差异的代谢功能。结果显示，在高丰度的代谢功能中，试验组大鼠回肠微生物在“能量代谢”功能上的丰度显著低于对照组(P<0.05)，在“膜转运”、“外源物质生物降级和代谢”和“其他氨基酸代谢”功能上的丰度显著高于对照组(P<0.05)。

注：*表示差异显著(P<0.05)，**表示差异极显著(P<0.01)图2 壳聚糖螯合锌对大肠杆菌攻毒大鼠回肠微生物门水平的影响

图3 回肠食糜微生物在KEGG第二层级水平上的功能预测

2.4 壳聚糖螯合锌对大肠杆菌攻毒大鼠回肠食糜微生物代谢产物的影响

对回肠食糜中短链脂肪酸和乳酸的浓度进行测定，如表3所示，试验组丙酸和丁酸的浓度显著高于对照组(P<0.05)，且总短链脂肪酸有增加的趋势(0.05

表3 壳聚糖螯合锌对大肠杆菌攻毒大鼠回肠食糜短链脂肪酸和乳酸浓度的影响

2.5 回肠食糜微生物与代谢产物的相关性分析

使用皮尔森相关性分析方法对回肠食糜微生物和代谢产物的相关关系进行分析，结果如图4所示，首先对回肠微生物之间的相关性分析发现，厚壁菌门的丰度与拟杆菌门、变形菌门和疣微菌门的丰度呈显著负相关(P<0.05)，与Romboutsia属和苏黎世杆菌属的丰度呈显著正相关(P<0.05)。变形菌门的丰度与疣微菌门和脱硫弧菌丰度呈显著正相关(P<0.05)，与Romboutsia属和苏黎世杆菌属的丰度呈显著负相关(P<0.05)，Romboutsia属丰度与苏黎世杆菌属的丰度呈显著正相关(P<0.05)，狭义梭菌属于Romboutsia属和苏黎世杆菌属的丰度呈显著负相关(P<0.05)。然后对回肠微生物与代谢产物之间的相关性分析发现，丙酸浓度与厚壁菌门和Romboutsia属的丰度呈显著正相关(P<0.05)，与变形菌门和疣微菌门的丰度呈显著负相关(P<0.05)，丁酸浓度与厚壁菌门、Romboutsia属和苏黎世杆菌属的丰度呈显著正相关(P<0.05)，同时也与变形菌门和疣微菌门的丰度呈显著负相关(P<0.05)。同时，乳酸浓度与厚壁菌门和Romboutsia属的丰度呈显著正相关(P<0.05)，与变形菌门的丰度呈显著负相关(P<0.05)。

注：蓝色表示正相关，红色表示负相关，＊表示相关性显著图4 回肠食糜微生物与代谢产物的皮尔森相关性分析

3 讨论

16S rRNA高通量测序技术已经成为近些年来肠道微生物菌群结构研究的主要手段，具有高准确性、高灵敏度等突出优势。因此，本试验采用16S rRNA V3-V4区域基因扩增子技术，在Illumina Miseq测序平台上对大鼠回肠食糜样本进行高通量测序，研究壳聚糖螯合锌对大肠杆菌攻毒断奶大鼠回肠菌群结构的影响，在门和属水平找出不同肠段的差异菌，揭示壳聚糖螯合锌对攻毒大鼠肠道微生物区系的影响。

动物肠道中复杂而多样的微生物共存并处于一个动态平衡状态，它们对机体健康具有重要作用。本试验中，回肠微生物Simpson指数和Shannon指数结果显示，壳聚糖螯合锌处理后回肠微生物菌群的多样性显著降低。Shannon指数的计算公式是：H=-∑(Pi)(log2Pi)，Pi表示某种个体数占总个体数比例。个体分配越均匀，Shannon指数就越大。Simpson指数的计算公式为：D=1-∑(Ni/N)2，表示随机取样的两个个体属于同种的概率，样本越均匀，Simpson指数的值越大。由此可以推测日粮添加壳聚糖螯合锌使得回肠菌群发生改变。

对回肠微生物门水平分析发现，厚壁菌门和拟杆菌门为优势菌门，且壳聚糖螯合锌组厚壁菌门和拟杆菌门变化明显。研究指出，与人类肠道微生物组成一样，小鼠体内最丰富的两个细菌门是厚壁菌门(60%～80%)和拟杆菌门(20%～40%)[14]。厚壁菌门/拟杆菌门这一比值是一种有效的指示动物肠道微生物状态的指标，尤其是厚壁菌门的变化将直接影响机体能量摄取和脂肪代谢作用机制。厚壁菌门和拟杆菌门的丰度与脂肪沉积存在相关关系，综合表现为脂肪沉积高的厚壁菌门/拟杆菌门较高[15]。本试验中，壳聚糖螯合锌显著上调了回肠微生物厚壁菌门的相对丰度，并有下调拟杆菌门丰度的趋势。Turnbaugh等[16]表示肥胖与厚壁菌门和拟杆菌门的变化有关，并且他们使用宏基因组和生化分析发现，肥胖小鼠肠道微生物DNA中富含有一些编码裂解多糖起始酶的环境基因标记，并且在肠道中发现丁酸和乙酸等发酵终产物增加，由此说明，高厚壁菌门/拟杆菌门比例会影响小鼠肠道微生物的代谢潜能，从而使肥胖微生物从日粮中获得能量的能力增强。以上结果与本试验有着一致的肠道菌群类型，即高比例的厚壁菌门和低比例的拟杆菌门，说明壳聚糖螯合锌可能通过改变肠道微生物菌群结构而影响大肠杆菌攻毒大鼠回肠微生物发酵能力来提供机体能量，促进生长发育。另外，回肠壳聚糖螯合锌试验组变形菌门、放线菌门和疣微菌门相对丰度都显著的低于对照组。变形菌门是革兰阴性菌的主要菌门，包括多种病原微生物，如大肠杆菌、沙门菌、志贺杆菌等，可能导致某些特性疾病，如炎症性肠病[17]。放线菌门的范围很广，既包括肠道共生菌双歧杆菌，又包括一些致病菌，如结核分枝杆菌、链霉菌等[18]。而疣微菌门则主要由一些环境微生物组成。

在属水平上，添加壳聚糖螯合锌显著增加了回肠微生物中Romboutsia属和苏黎世杆菌属的相对丰度，此外，虽然乳杆菌属组间差异不显著，但作为丰度最高的属，试验组有益菌乳杆菌属相对丰度在数值在远远高于对照组。有报道指出，Romboutsia属和苏黎世杆菌属均表现出益生性，张李荣等[19]研究发现乳双歧杆菌可显著提高Romboutsia属、乳杆菌属等有益菌含量；刘佳星等[20]在四神丸对腹泻型肠易激综合征大鼠肠道菌群影响的实验研究中发现，与模型组相比，四神丸组苏黎世杆菌属和Romboutsia属丰度显著增加。而壳聚糖螯合锌试验组狭义梭菌属丰度显著降低可能是由于乳酸杆菌属、Romboutsia属和苏黎世菌属所占比例很高，导致其他属于厚壁菌门的菌属所占比例相对减少所致。另外，变形菌门主要变化菌属脱硫弧菌属在添加壳聚糖螯合锌的试验组中极显著的降低了。脱硫弧菌属是肠道菌群中主要的硫酸盐还原菌(SRB)，有报道指出硫酸盐还原菌在厌氧呼吸过程中将硫酸盐还原为硫化氢，干扰上皮细胞氧化代谢，可能导致上皮细胞损伤死亡以及黏膜炎症[21-22]。Rowan等[23]研究发现，溃疡性结肠炎患者结肠脱硫弧菌丰度显著增加。综上所述，日粮补充壳聚糖螯合锌对大肠杆菌攻毒大鼠回肠微生物菌群结构产生了一定的影响，增加了厚壁菌门/拟杆菌门的比值以及有益菌Romboutsia属、苏黎世菌属的相对丰度，同时降低了促炎菌脱硫弧菌属的相对丰度。

TaxFun4是一个基于16S rRNA数据预测微生物群落功能的软件包，研究指出，TaxFun4预测结果很好地近似于全基因组鸟枪法测序方法得到的功能分析[24]。通过对功能基因的预测和相关途径的分析，可能发现能够降解有毒有害代谢物的新基因或新的酶，从而帮助宿主抵抗病原体入侵。本研究结果显示，回肠中添加壳聚糖螯合锌，回肠微生物在“膜转运”、“外源物质生物降级和代谢”和“其他氨基酸代谢”等功能上的富集增加，在“能量代谢”功能上的富集降低，此结果与Li等[25]的研究结果一致，当发生腹泻时，机体的代谢过程发生了变化，包括“碳水化合物代谢”富集降低，“氨基酸代谢”、“能量代谢”的富集水平增加。

微生物发酵可以产生一系列的代谢产物，如乙酸、丙酸、丁酸等，这些产物的浓度可以作为衡量肠道内微生物活性和肠道健康的标志[26]。一方面，短链脂肪酸为肠黏膜提供能量，另一方面，肠道内短链脂肪酸可以降低肠道内pH值，营造了一个不适合有害菌如大肠杆菌等生长的酸性环境，进而抑制有害菌的生长。本研究结果发现，添加壳聚糖螯合锌使得回肠丙酸、丁酸浓度显著增加，并且总短链脂肪酸浓度有增加的趋势。Tedelind等[27]发现短链脂肪酸尤其是丁酸可以通过抑制LPS诱导的TNF-α激活NF-κB来发挥抗炎作用。另有研究表明，高水平的短链脂肪酸可以抑制某些病原菌的生长，比如沙门菌、大肠杆菌等[28]。皮尔森相关性分析发现丙酸和丁酸的浓度与Romboutsia属和苏黎世菌属丰度呈显著正相关，因此短链脂肪酸的增加可能是由于产酸菌Romboutsia属和苏黎世菌属丰度的增加所引起的。另外，壳聚糖螯合锌处理还增加了乳酸的浓度，乳酸盐是小肠内重要的细菌发酵产物，能降低小肠内的pH值，抑制病原菌的活性。研究指出乳酸并不会在肠道中积累，通常会被不同的乳酸利用菌代谢成乙酸、丙酸和丁酸[29]。并且，相关性分析也同样指出乳酸的浓度与Romboutsia属和苏黎世菌属丰度呈显著正相关。总之，日粮添加壳聚糖螯合锌通过增加产酸菌的相对丰度来增加肠道内短链脂肪酸和乳酸浓度从而有助于维持大肠杆菌攻毒大鼠的肠道健康。

4 结论

壳聚糖螯合锌通过上调有益菌Romboutsia属和苏黎世菌属的相对丰度，同时下调促炎菌脱硫弧菌的丰度，调节大肠杆菌攻毒大鼠回肠微生物菌群，使得微生物代谢产物短链脂肪酸和乳酸的浓度增加，有利于维持肠道健康。