嗜热链球菌S10复合植物乳杆菌P-8发酵豆乳中挥发性风味物质的SPME-GC-MS分析

郭 帅 韩之皓 白 梅 孙天松 张和平 王记成

（内蒙古农业大学 乳品生物技术与工程教育部重点实验室农业农村部奶制品加工重点实验室 呼和浩特010018）

全球发酵产品市场中，发酵豆乳份额远低于酸奶市场，豆腥味是制约其发展的主要原因[1-2]。发酵剂的改变可引起风味差异，对成品中风味物质数量与含量起关键作用。固相微萃取（Solid phase microextraction，SPME）技术具有灵敏度高，检出限低，分析范围广，萃取条件温和等特点，可直接与气相色谱-质谱（Gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）联用。近年来，SPME 技术在食品风味分析，如酿造醋[3]、红酒[4]、果蔬[5]等应用越来越广。食品体系风味特征形成是挥发性物质相互影响共同作用的结果[6]。微量杂质存在也会导致整体风味改变，同一种物质的风味因浓度、结构不同而有所差异。本研究菌种嗜热链球菌S10（Streptococcus thermophilus S10）是在乳品生物技术与工程教育部重点实验室乳酸菌菌种资源库的406 株嗜热链球菌中筛选得到的一株具有良好发酵大豆乳特性和弱化后酸能力较好的嗜热链球菌[7]。植物乳杆菌P-8（Lactobacillus plantarum P-8） 是本实验室于2005年分离自内蒙古巴彦淖尔市乌拉特中旗草原上牧民家庭自然发酵酸牛乳样品中的1 株具有优良益生特性的植物乳杆菌[8]。本试验中采用SPME-GC-MS 技术和面积归一法，结合主成分和聚类分析探究嗜热链球菌S10 与植物乳杆菌P-8（S10+P-8）复合发酵豆乳样品中挥发性风味物质以及引起豆腥味的关键物质含量变化，为发酵剂S10+P-8 商业化提供理论数据，为功能性发酵豆乳开发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

全脂大豆粉，蛋白质含量≥39%，黑龙江农垦龙王食品有限公司。

试验用嗜热链球菌S10 和植物乳杆菌P-8 直投式发酵剂由乳品生物技术与工程教育部重点实验室乳酸菌菌种资源库提供；商业豆乳发酵剂1和商业豆乳发酵剂2（商业1，商业2）分别购自科汉森（中国）有限公司、丹尼斯克（中国）有限公司。

1.2 仪器与设备

7890A-5977B GC-MS 联用仪、色谱柱为HP-5 毛细管柱 （30 m×0.25 mm，0.25 μm），美国Agilent 公司；手动固相微萃取进样手柄、50/30 μm 二乙基苯/碳分子筛/聚二甲基硅氧烷（divinylbenzene/carboxen/polydimethylsiloxane，DVB/CAR/PDMS）萃取头，美国Supelco 公司。

1.3 试验方法

将全脂豆粉（6.6%）与蔗糖（8%）混合后加入到60 ℃蒸馏水 （85.4%） 搅拌均匀，于65 ℃、30 MPa 条件下均质，95 ℃杀菌5 min，冷却至（42 ±0.5）℃接种发酵剂[9]。样品于42 ℃恒温发酵至pH值低于4.50 后，转至4 ℃过夜后熟结束。接种量依据商业发酵剂产品说明0.03 g‰添加，试验组接种量比例按照S10∶P-8 为1 000∶1 添加，其中S10 添加量为2×106CFU/mL。

1.4 挥发性风味物质测定

GC 条件：HP-5 毛细管柱 （30 m×0.25 mm，0.25 μm）；采用程序升温方式，起始温度35 ℃，保持5 min，以5 ℃/min 的速率上升至10 ℃，保持2 min，以10 ℃/min 的速率上升至250 ℃，保持3 min；汽化室温度为250 ℃；载气为He，流速1.0 mL/min；不分流进样。MS 条件：电子电离源；电子能量70 eV；离子源温度230 ℃；质量扫描范围m/z 33～450；发射电流100 μA。萃取条件：萃取头老化温度250 ℃，老化时间15 min，平衡温度50 ℃，平衡时间60 min；25 ℃解吸附3 min。

1.5 定性与定量分析

利用随机携带Masshunter 工作站NIST 11 标准库自动检索各组分质谱数据，利用面积归一化法计算各组分峰面积百分比（相对含量）。

1.6 数据处理

利用SPSS 21.0 软件作为数据分析工具进行显著性、主成分分析处理。作图采用Origin lab 2017、SIMCA-P 14.1 和R 语言。

2 结果与分析

2.1 发酵豆乳样品GC-MS 结果总体描述

采用50/30 μm DVB/CAR/PDMS 萃取头，对原豆乳及3 种发酵豆乳样品发酵完成及后熟结束的挥发性风味物质进行富集，利用GC-MS 技术对发酵豆乳的风味物质进行检测分析，经NIST 11标准库检索各组分挥发性成分，利用面积归一化法计算各组分相对峰面积百分比，由表1可知，原豆乳共检出32 种挥发性物质，与Zhang 等[10]研究结果相符。3 种发酵豆乳在发酵完成和后熟结束总计6 组样品共检出124 种挥发性风味物质，包括醛类、酮类、酸类、酯类、醇类、烷烃类和含氮化合物等。接种发酵剂不同，风味物质组成和含量也不同。总峰面积代表样品挥发性风味物质总量，除去萃取头带有少量硅氧烷类杂质峰，结合表1、图1a总峰面积可知，经发酵后，3 种样品风味物质总量相比原豆乳有显著提高（P<0.05）；发酵完成与后熟结束相比有显著变化（P<0.05），后熟结束含量更高；S10+P-8 组与对照组相比含量更高，具有显著差异（P<0.05）。样品中总挥发性物质数量如图1b所示，3 种样品发酵完成时风味物质数量分别是50 种、32 种和48 种，差异显著（P<0.05）。后熟结束时风味物质数量分别是53 种、50 种和50种，无显著差异。对照组发酵完成与后熟结束挥发性风味物质数量有显著变化（P<0.05）。原豆乳和发酵豆乳样品不同种类挥发性物质及相对百分含量如图1c、图1d所示，原豆乳与发酵豆乳样品主要在酮类、酸类、醇类和烷烃化合物上存在显著差异（P<0.05），S10+P-8 组与对照组无显著差异；挥发性风味物质种类在醛类、酮类、醇类和烷烃类化合物有显著差异（P<0.05）；与对照组相比，S10+P-8 组醛类化合物和醇类化合物含量少，差异显著（P<0.05）；酮类化合物含量多，差异显著（P<0.05）。

2.2 发酵豆乳样品致豆腥味挥发性物质分析

表1 原豆乳及发酵豆乳样品中挥发性风味物质SPME-GC-MS 分析结果Table 1 Major volatile compounds extracted from soybean milk and fermented soybean milk samples by SPME-GC-MS

（续表1）

（续表1）

（续表1）

发酵豆乳风味是多种挥发性微量风味物质共同作用而达到相对平衡状态的复杂体系。豆乳中特有的豆腥风味是制约豆乳制品被消费者接受的主要问题，在西方国家更为明显，研究者常用“豆腥味”、“生味”、“青草味”、“油脂氧化味”、“油漆味”和“金属味”等术语描述豆腥味[11]。已有研究确定了影响豆乳及发酵豆乳风味的12 种最主要挥发性物质成分[10，12]，并认为这些物质能够基本代表发酵豆乳整体风味。其中己醛、（E）-2-己烯醛、1-辛烯-3-醇、1-己醇、戊醇、乙酸、苯甲醛、（E，E）-2，4-癸二烯醛这8 种化合物分别呈割青草的味道、生味、磨茹、酸味、苦杏仁味和辛辣味而不被人喜欢，因此定义为豆腥味物质；3-甲基正丁醛、（E）-2-辛烯醛、正壬醛和（E）-2-壬烯醛呈黑巧克力、青瓜、绿菜花和水果味，被人们喜欢，定义为非豆腥味物质。此外，有研究认为2-戊基呋喃呈豆腥味[13]，正壬醛含量较多时产生较浓油脂氧化味而引起不愉快味道[14]。乳酸菌发酵可有效降低或消除发酵豆乳豆腥味[9，15]，己醛是豆腥味挥发性物质的最主要成分[11]，1-辛烯-3-醇和（E）-2-己烯醛次之，1-己醇、（E，E）-2，4-癸二烯醛等再次之。己醛含量降低程度可作为衡量发酵菌种对豆腥味降低效果的重要指标[10，12，16]。结合表1和图2a可知，原豆乳及发酵豆乳样品中上述挥发性物质除戊醇均有检出，原豆乳己醛含量为33.27%，Achouri 等[17]研究了豆乳气味的组成成分，结果发现豆乳中致豆腥味己醛有较高含量。样品中呈豆腥味挥发性物质总含量如图2a所示，经发酵后，3 种发酵豆乳样品中致豆腥味挥发性物质总量均显著降低（P＜0.05）；S10+P-8 组与对照组相比下降量更大，差异显著 （P＜0.05），后熟结束时S10+P-8 组总量为24.33%，对照组分别是46.79%和44.59%。各致豆腥味挥发性物质含量变化如图2b所示，样品中主要衡量豆腥味浓淡的挥发性物质己醛含量均显著降低（P＜0.05）；发酵完成与后熟结束相比，S10+P-8 组和商业2 组无显著变化，商业1 组变化显著（P＜0.05）；S10+P-8 组显著低于对照组（P＜0.05），后熟结束己醛相对含量为5.62%，对照组分别是20.16%和15.44%；挥发性物质（E，E）-2，4-癸二烯醛、2-戊基呋喃含量明显下降（P＜0.05），其余物质如1-己醇、苯甲醛含量增多，这与早期研究结果有差异，可能是发酵菌种或豆粉选择导致[18-19]。结合上述结果可推测，部分豆腥味成分残留可能是豆乳发酵体系中仍留存豆腥味的主要原因。此外，风味物质与大豆蛋白能发生疏水结合，其结合常数随碳链数的增加而升高，可能是导致豆腥味在发酵过程中难以除去的原因[20]，如己醛等物质。在发酵豆乳中有时会产生具有淡淡“臭脚丫味”的风味物质，含量低于仪器检测限，无法直接获知其相关信息，结合已有文献，此物质为异戊酸，是大豆发酵制品中常见的一种特征风味成分[21]。

图1 原豆乳及发酵豆乳样品挥发性风味物质总体分析Fig.1 Total analysis of volatile flavor substances in soybean milk and fermented soybean milk samples

图2 原豆乳及发酵豆乳样品中呈豆腥味挥发性物质总百分含量（a）和各物质所占百分含量（b）分析Fig.2 Total analysis Comparison of beany flavor of volatile flavor in soybean milk and fermented soybean milk

2.3 发酵豆乳样品不同种类挥发性风味物质主成分分析

主成分分析是通过少数几个主分量解释多变量间的内部关系，使样品中物质种类及含量有较客观反映，发酵豆乳中挥发性风味物质的数据用主成分分析来处理是一种既可行的又科学的方法[22]。得分图中样品点越接近，其香气组成及含量相似度越高。样品点与不同种类风味物质在得分图与载荷图上越接近，说明有较高相关性。将原豆乳及发酵豆乳所含8 类挥发性风味物质进行主成分分析，主成分特征值及方差贡献率如表2所示，经主成分分析发现，不同发酵豆乳样品挥发性物质种类主要集中在前3 个主成分，累计方差贡献率达到88.590%。由图3a因子得分图可知，在第1主成分上，7 种样品从左至右共3 个集合出现较为明显的区分，说明接种发酵剂不同对风味物质产生有较大影响，S10+P-8 组与对照组、原豆乳有较明显区分和聚类趋势，2 种对照组空间排布较接近，原豆乳与3 种发酵豆乳区分明显。因此，可定性的认为试验组与对照组、原豆乳的挥发性风味物质存在较大差异；第2 主成分无明显规律。结合图3a和图3b可知，商业1 组和商业2 组发酵完成样品与烷烃类化合物呈正相关；商业2 组后熟完成与醇类、脂类和酸类化合物呈正相关；商业1 组发酵完成、S10+P-8 组发酵完成和后熟结束与含氮和酮类化合物具有正相关；原豆乳与醛类和其它种类化合物具有正相关。

表2 原豆乳及发酵豆乳样品与不同种类挥发性风味物质主成分特征值及方差贡献率Table 2 Soybean milk and fermented soybean milk samples with different volatile flavors eigenvalues of principal components and their variance contributions

图3 不同发酵豆乳样品（a）和挥发性风味物质种类（b）主成分载荷图Fig.3 Principal component analysis loading plots of fermented soybean milk samples （a） and key volatile compounds （b）

2.4 发酵豆乳样品主要挥发性物质主成分及聚类分析

在2.2 节中提到，发酵豆乳风味主要由几种挥发性风味物质共同呈现，除前文提到的风味物质以外，双乙酰、乙醛、乙酸、己酸及戊醇等物质也可对发酵豆乳风味进行修饰[23-24]。选样品中检测到含量较高的挥发性风味物质共22 种进行分析，其相对含量接近80%或更高，主成分特征值及方差贡献率如表3所示，经主成分分析发现，主要挥发性物质主要集中在前4 个主成分，累计方差贡献率达到94.468%。结合图4a和图3a可知，两种主成分分析聚类相似，即选取主要挥发性物质进行统计分析可代表整体发酵豆乳风味。由图4a和图4b可知，S10+P-8 组发酵完成和后熟结束与乙醛、己酸、乙偶姻、双乙酰、丙酮酸等物质呈正相关；两种对照样品与乙酸、苯甲醛、1-己醇、（Z）-2-庚烯醛等挥发性物质呈正相关；原豆乳样品与1-辛烯-3-醇、（E，E）-2，4-癸二烯醛、3-甲基正丁醛和己醛等呈正相关。结合表1和图4b可知，S10+P-8组样品风味与含有较多含量的乙偶姻、双乙酰、乙酸、己酸和乙醛等挥发性物质有关。其中，双乙酰、乙偶姻是发酵奶制品中重要的特征风味物质之一，可赋予发酵豆乳特有的呈“乳脂气息”、“干酪香气”和“豆香味”[23，25]；Blagden 等[19]发现乳酸菌发酵豆乳后可产生乳酸、柠檬酸和乙酸等有机酸，并将柠檬酸代谢过程中生成的α-乙酰乳酸转变成具有发酵豆乳特征香气的双乙酰；乙酸、戊酸、己酸赋予发酵豆乳爽口酸味[26]；而乙醛与其它挥发性风味物质相互协同作用，可改善发酵豆乳风味[27]。3 种发酵豆乳后熟结束后，双乙酰含量分别为8.77%、2.99%和1.06%，乙醛含量分别是2.89%、1.24%和1.50%。乙醛/双乙酰的含量比例对发酵豆乳风味影响较大，当乙醛/双乙酰比例在0.22～0.33 范围内时，会呈现诱人的芳香味，否则会有酸腐味或其它令人不愉快的味道[27]。本研究检出3种发酵豆乳乙醛与双乙酰含量比例分别为0.30，0.41 和1.41，试验组乙醛/双乙酰比值对其持有豆香味和清香味有积极作用。双乙酰和乙醛是发酵制品中特有的风味物质，它们对许多有害微生物有较强抑制作用，其含量差异可能与嗜热链球菌菌株间差异性有关[28]。

表3 原豆乳及发酵豆乳样品与主要挥发性风味物质主成分特征值及方差贡献率Table 3 Soybean milk and fermented soybean milk samples with major flavor compounds eigenvalues of principal components and their variance contributions

图4 不同发酵豆乳样品（a）和主要挥发性风味物质（b）主成分载荷图Fig.4 Principal component analysis loading plots of fermented soybean milk samples （a） and key volatile compounds （b）

不同样品主要挥发性风味物质聚类分析如图5所示，S10+P-8 组发酵完成和后熟结束样品，商业1 组后熟结束和后熟结束样品，商业2 组后熟结束和后熟结束样品挥发性风味物质种类和含量相似，分别聚为一枝，原豆乳与其它样品差异显著，这一结果与主成分分析结果相似。在所有样品中，乙酰丙酮、（E，E）-2，4-癸二烯醛、1-己醇、双乙酰、己醛、己酸和乙偶姻含量差异较大，己酸和乙偶姻含量差异最大；原豆乳中（E，E）-2，4-庚二烯醛、（E，E）-2，4-癸二烯醛、2-戊基呋喃、己醛和正壬醛含量远高于发酵豆乳样品，差异显著（P＜0.05），这与施小迪[29]研究结果相符。由此可知，S10+P-8 组样品具有更低含量致豆腥味挥发性风味物质，与对照组差异显著（P＜0.05）。

图5 原豆乳及发酵豆乳样品聚类分析Fig.5 Soybean milk and fermented soybean milk samples cluster analysis

3 结论

本试验应用SPME-GC-MS 技术，结合主成分分析和聚类分析研究S10+P-8 发酵豆乳中的挥发性风味物质。与两种商业豆乳发酵剂相比，后熟结束时S10+P-8 发酵豆乳样品的挥发性风味物质总峰面积更大，数量更多（52 种），致豆腥味挥发性物质相对总含量更低（24.33%），主要致豆腥味挥发性物质己醛含量为5.62%，呈豆香味和清香味挥发性物质，如乙偶姻、双乙酰、乙酸、己酸和乙醛等含量较高，其中乙醛/乙偶姻的比例为0.30%，有诱人豆乳芳香味。S10+P-8 组与对照组、原豆乳在挥发性风味物质种类和主要挥发性物质上有明显区分，各组分相对含量及致豆腥味风味物质含量均优于商业豆乳发酵剂1 和商业豆乳发酵剂2。本研究为S10+P-8 在商业化生产中提供了理论数据和参考依据。