马鲛鱼内脏抗氧化肽口服液的研制

薛雅茹

(黎明职业大学 材料与化学工程学院，福建 泉州 362000)

抗氧化肽指的是由2～100个氨基酸聚合而成的、能够清除人体内自由基的肽，具有分子质量低、易消化吸收、抗氧化活性高、安全无副作用的特点[1]。目前，抗氧化肽的研究大多集中在制备[2-3]、分离纯化和结构鉴定[4-7]等方面的研究，相关产品的开发仍较为局限。马鲛鱼(Scomberomorusniphonius)，又名鲅鱼，主要分布在黄海、渤海和福建沿海等地[8]。在加工过程中产生的大量内脏、鱼头等副产物，重量约占原料鱼的40%～55%[9]。其内脏中含有丰富的蛋白和人体必需氨基酸，是制备肽类及其相关产品的良好来源，但在加工时常因利用率不足被丢弃，严重污染环境。目前，对马鲛鱼的研究主要在于肌肉、鱼皮、鱼骨，而马鲛鱼内脏精深加工的相关研究尚未见报道[10-13]。因此，对马鲛鱼内脏进行精深加工，开发一种具有抗氧化活性功能的肽口服液，不仅能提高马鲛鱼的加工附加值，拓宽马鲛鱼的资源利用范围，也能减少环境污染，促进马鲛鱼产业的发展。基于此，本文以马鲛鱼内脏抗氧化肽粉为原料，先对其进行脱腥试验，接着添加蜂蜜、柠檬酸、羧甲基纤维素钠(CMC)，研制成一款具有抗氧化活性的口服液，为马鲛鱼内脏的精深加工和抗氧化肽相关产品的开发提供一些参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

马鲛鱼内脏抗氧化肽粉，实验室自制；活性干酵母，安琪酵母股份有限公司；活性炭，河南崇轩净水材料有限公司；β-环状糊精，上海源叶生物科技有限公司；CMC(羧甲基纤维素钠)，常州市国宇环保科技有限公司；蜂蜜、柠檬酸，上海鑫彭淀粉糖有限公司；DPPH·(二苯代苦味肼基自由基)，美国Sigma 公司；所使用的检测试剂均为分析纯。

MJ-BL1503B型多功能食品料理机，美的集团有限公司；HHS型电热恒温水浴锅，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；DHG-9140 (A)型电热鼓风干燥箱，上海精宏试验设备有限公司；TG16-WS型台式高速离心机，湖南湘仪实验仪器制造有限公司；FD-1型冷冻干燥机，北京博医康试验仪器有限公司；DHP350型电热培养箱，武汉瑞华仪器设备有限责任公司；XFH-30CA型电热式灭菌器，浙江新丰医疗器械有限公司；Stab S2型全温振荡培养箱，上海润度生物科技有限公司；XK97-K型菌落计数器，力辰科技邦西仪器(上海)有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 工艺流程

马鲛鱼内脏抗氧化肽粉末—脱腥—混合调配—灌装与灭菌—成品。

1.2.2 操作要点

1.2.2.1 脱腥

将10 g抗氧化肽粉末溶解于100 mL去离子水中，配成质量分数为10%的抗氧化肽溶液，加入脱腥剂，在一定的条件下进行脱腥。脱腥结束后用滤纸过滤，滤液即为脱腥后的马鲛鱼内脏抗氧化肽溶液。

1.2.2.2 混合调配

取50 mL脱腥后的抗氧化肽溶液，按比例加入蜂蜜、柠檬酸、CMC，使其充分混合。

1.2.2.3 灌装与灭菌

选择棕色口服液瓶对抗氧化肽口服液进行灌装，置于121 ℃的高压蒸汽灭菌锅中灭菌20 min，密封，得到成品。

1.2.3 脱腥剂的筛选

将活性炭、活性干酵母、β-环状糊精分别加入100 mL质量分数为10%的马鲛鱼内脏抗氧化肽溶液中，按照表1所示的脱腥条件对马鲛鱼内脏抗氧化肽溶液进行脱腥[14]。

表1 三种脱腥剂的脱腥条件

1.2.4 马鲛鱼内脏抗氧化肽溶液腥味感官评定标准

挑选10名嗅觉和味觉较敏感的人员组成评定小组，通过先闻后尝的方式，为抗氧化肽溶液的腥味评分[15]。以去离子水为对照，其分值为0；腥味程度依次为：重、较重、一般、较轻、略有、无，分别对应5、4、3、2、1、0分。

1.2.5 DPPH·清除率的测定

参考Liu等[16]的方法并加以改进。将2 mL的抗氧化肽溶液加入到2 mL的2.0×10-4mol/L的DPPH·溶液中，均匀混合，在黑暗处放置30 min后，用紫外分光光度计测定样品在517 nm条件下的吸光度值(A2)。以2 mL无水乙醇与 2 mL DPPH·溶液的吸光度为空白管(A0)，以2 mL抗氧化肽溶液+2 mL无水乙醇的吸光值为对照管(A1)。清除率用下列公式计算：

(1)

式(1)中，A0为2 mL无水乙醇+2 mL DPPH·溶液的吸光值；A1为2 mL 抗氧化肽溶液+2 mL无水乙醇的吸光值；A2为2 mL 抗氧化肽溶液+2 mL DPPH·溶液的吸光值。

1.2.6 抗氧化活性损失率

抗氧化活性以损失率以DPPH·清除率的损失率计算[14]，分别测定脱腥前后抗氧化肽溶液的DPPH·清除率。损失率用下列公式计算：

(2)

式(2)中，E0为脱腥前的抗氧化肽溶液的DPPH·清除率；E1为脱腥后的抗氧化肽溶液的DPPH·清除率。

1.2.7 单因素试验设计

以感官评分为指标，研究蜂蜜添加量、柠檬酸添加量、CMC添加量这3个因素对马鲛鱼内脏抗氧化肽口服液感官品质的影响。

1.2.8 响应面试验设计

在单因素试验的基础上，以感官评分分值为响应值，以A(蜂蜜添加量)、B(柠檬酸添加量)、C(CMC添加量)为自变量。采用Box-Behnken中心组合试验设计，设计三因素三水平响应面试验。试验共17个试验点，其中12个为析因点，自变量取值在A、B、C所构成的三维顶点，5个为零点，为区域中心点，以估计误差。因素水平编码值如表2所示。试验以随机次序进行，重复3次，取平均值。

表2 响应面分析试验因素水平

1.2.9 马鲛鱼内脏抗氧化肽口服液感官评分标准

运用综合评判模型(色泽、组织、滋味、香气、口感)，由10名人员组成评定小组，进行感官检验[17]。以去离子水为对照，其分值为0分。评分标准如表3所示。

表3 感官评定标准

1.2.10 口服液成品质量的检测

感官指标的测定参考GB 7101—2015《食品安全国家标准 饮料》；铅的测定参考GB 5009.12—2017《食品安全国家标准 食品中铅的测定》；砷的测定参考GB 5009.11—2014《食品安全国家标准 食品中总砷及无机砷的测定》；菌落总数的测定参考GB 4789.2—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》；大肠菌群的测定参考GB 4789.3—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠菌群计数》；霉菌和酵母的测定参考GB 4789.15—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 霉菌和酵母计数》。

1.2.11 数据处理

单因素试验采用Origin 9.1软件绘图，响应面试验采用Design Expert V8.0.6软件分析及绘图，数据处理采用SPSS软件，试验重复3次，结果以重复试验数据的均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 脱腥剂的筛选结果

图1为不同脱腥剂的脱腥效果。由图1可知，采用活性炭脱腥后马鲛鱼内脏抗氧化肽溶液感官品质较好，但抗氧化活性损失率最高；利用β-环状糊精脱腥后抗氧化活性损失率较低，但感官品质最差；活性干酵母的脱腥效果最好，抗氧化肽活性损失率最低。这可能是由于活性炭多孔结构的超强吸附力，在吸附腥味物质的同时也破坏了抗氧化肽的活性；β-环状糊精需利用其具有的立体疏水空腔，在范德华力、疏水作用力等的作用下，与客体分子结合形成超微囊状包合物，从而达到脱腥的目的；而活性干酵母则是通过将腥味物质转化且发酵过程中产生对异味有隐蔽作用的中间代谢产物的方式进行除腥[14]。因此，选择活性干酵母进行后续的试验。

2.2 单因素试验结果分析

2.2.1 蜂蜜添加量对抗氧化肽口服液感官品质的影响

取50 mL脱腥后的10%马鲛鱼内脏抗氧化肽溶液，以感官评分为指标，在柠檬酸添加量0.15%，CMC添加量0.15%，蜂蜜添加量分别为6.0%、8.0%、10.0%、12.0%、14.0%条件下研制口服液，结果如图2所示。

由图2可知，在6%～10%范围内，感官评分随着蜂蜜添加量的升高而显著升高(P<0.05)；在10%～14%范围内，感官评分随着蜂蜜添加量的增加而减小(P<0.05)。这可能是因为在一定的条件下蜂蜜的添加可以中和柠檬酸的酸味，掩盖抗氧化肽的苦味，但当蜂蜜添加量过多时会出现甜腻味，导致感官品质变差。因此，蜂蜜添加量考察范围定为8%～12%。

2.2.2 柠檬酸添加量对抗氧化肽口服液感官品质的影响

取50 mL脱腥后的10%马鲛鱼内脏抗氧化肽溶液，以感官评分为指标，在蜂蜜添加量10.0%，CMC添加量0.15%，柠檬酸添加量分别为0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%条件下研制口服液，结果如图3所示。

由图3可知，在0.05%～0.10%范围内，感官评分随着柠檬酸添加量的增加呈显著上升趋势(P<0.05)；在0.10%～0.25%之间，感官评分随着柠檬酸添加量的增加显著下降(P<0.05)。这可能是因为柠檬酸添加量的增加会使口服液的酸味增加，口感越来越爽口。但到达一定量时仍继续添加柠檬酸，会导致口服液味道过酸而出现不适感，还会和口服液中丰富的抗氧化肽发生蛋白质-多酚聚合物作用而产生轻微沉淀[18-19]。因此，柠檬酸添加量考察范围定为0.05%～0.15%。

2.2.3 CMC添加量对抗氧化肽口服液感官品质的影响

取50 mL脱腥后的10%马鲛鱼内脏抗氧化肽溶液，以感官评分为指标，在蜂蜜添加量10.0%，柠檬酸添加量0.15%，CMC添加量分别为0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%条件下研制口服液，结果如图4所示。

由图4可知，在0.05%～0.15%范围内，感官评分随着CMC添加量的增加而显著上升(P<0.05)；在0.15%～0.25%范围内，感官评分随着CMC添加量的增加而下降(P<0.05)。这可能是因为CMC的加入会使口服液的稳定性增加，但当添加量超过适宜添加量时口服液变得黏稠，沉淀增多，口感变差。因此，CMC添加量考察范围定为0.10%～0.20%。

2.3 响应面试验结果分析

2.3.1 响应面试验结果与方差分析

通过Design Expert v8.0.6对马鲛鱼内脏抗氧化肽口服液的感官评分回归模型进行显著性分析，响应面试验结果如表4所示。

表4 Box-Behnken试验设计及结果

表4(续)

综上分析可得，该模型可以用来分析、预测马鲛鱼内脏抗氧化肽口服液的研制条件。

经回归拟合后，试验因子对响应值的影响可用回归方程表示为：Y=4.71-0.033A+0.066B+0.029C-0.065AB+0.018AC-0.13BC-0.20A2-0.024B2-0.12C2。

表5为回归方程模型的方差分析。

表5 回归方程模型的方差分析

从表5可以看出，方程一次项中，A、B、C均达到显著水平(P<0.05)，对感官评分有一定的影响，其中，B达到极显著水平(P<0.01)。在二次项中，A2、B2、C2(P<0.01)为显著项，且系数均为负值，说明方程的抛物线函数开口向下，具有极大值点可进行优化分析。交互项中，AB、BC达到极显著水平(P<0.01)，AC影响不显著(P>0.05)，可以看出各具体试验因子对响应值的影响不是简单的线性关系。3个因子对马鲛鱼内脏抗氧化肽口服液感官评分影响的大小依次为柠檬酸添加量(B)>蜂蜜添加量(A)>CMC添加量(C)，即柠檬酸添加量对马鲛鱼内脏抗氧化肽口服液感官评分的影响最为显著。

2.3.2 各因素的交互作用分析

由于响应曲面越陡峭，则表明响应值对于因素的改变越敏感；反之响应曲面越平缓，响应值对于因素的改变越迟钝。蜂蜜和柠檬酸添加量、柠檬酸和CMC添加量这两个交互作用曲面陡峭，等高线形状为椭圆形，说明蜂蜜和柠檬酸添加量、柠檬酸和CMC添加量对口服液的感官评分交互作用显著(P<0.01)；CMC和蜂蜜添加量的交互作用曲面较平缓，等高线形状趋于圆形，说明CMC和蜂蜜添加量对口服液的感官评分交互作用不显著(P>0.05)。

图5为当CMC添加量位于中心点即0.15%时，蜂蜜和柠檬酸添加量对感官评分的交互影响效应。

由图5可以看出，在蜂蜜添加量相同时，感官评分随着柠檬酸添加量的增加呈先上升后下降的趋势；在柠檬酸添加量相同时，感官评分随着蜂蜜添加量的增加而先增加后减少。响应曲面的坡度随蜂蜜添加量的改变，变化较为平缓，且在其等高线图中，等高线沿柠檬酸添加量轴变化的趋势明显高于蜂蜜添加量。由此可知，柠檬酸添加量对口服液感官评分的影响大于蜂蜜添加量。这可能是因为蜂蜜主要影响口服液的滋味，而柠檬酸的添加不仅会影响口服液的滋味，还会和与口服液中的蛋白质发生沉淀作用，进而影响口服液的组织状态，导致其对感官评分的影响高于蜂蜜添加量。

图6为当柠檬酸添加量位于中心点即0.15%时，蜂蜜和CMC添加量对感官评分的交互影响效应。

由图6可以看出，在蜂蜜添加量相同时，感官评分随着CMC添加量的增加而先增加后逐渐减少；在CMC添加量相同时，感官评分随着蜂蜜添加量的增加而先增加后缓慢下降。响应曲面的坡度随CMC添加量的增加变化较为平缓，在其等高线图中，等高线沿蜂蜜添加量轴变化的趋势略高于CMC添加量。由此可知，蜂蜜添加量对口服液感官评分的影响大于CMC添加量。这可能是因为蜂蜜主要影响滋味的分值，而CMC主要影响组织状态的分值，而滋味在总感官评分的比例高于组织状态。因此，蜂蜜添加量的改变对口服液感官评分的影响略高于CMC添加量。

图7为当蜂蜜添加量位于中心点即10.0%时，柠檬酸和CMC添加量对感官评分的交互影响效应。

由图7可以看出，在同一柠檬酸添加量下，感官评分随着CMC添加量的增加，先增加后缓慢减少；在同一CMC添加量下，感官评分随着柠檬酸添加量的升高，先升高后降低。这是因为当柠檬酸添加量一定时，适宜的CMC添加量可以使口服液的稳定性增加，使口服液口感越来越醇厚。但当CMC添加过量时，口服液的黏稠度增加，感官品质逐渐下降；当CMC添加量一定时，过量的柠檬酸添加量会使口服液的味道变得过酸，且过量的柠檬酸会和口服液中的多肽反应产生轻微絮凝，导致口服液的感官品质迅速下降。

由此可见，在不同条件下，马鲛鱼内脏抗氧化肽口服液的感官评分响应面结果与单因素结果具有较好的一致性。根据Design Expert v8.0.6对模型进行优化，得出结果：蜂蜜添加量9.80%、柠檬酸添加量0.107%、CMC添加量0.151 5%。在此条件下，模型预测马鲛鱼内脏抗氧化肽口服液的感官评分达到4.717。考虑到实际操作的可行性，结合上述优化条件，调整工艺条件为：蜂蜜添加量9.80%、柠檬酸添加量0.11%、CMC添加量0.15%。在此条件下进行3次验证试验，马鲛鱼内脏抗氧化肽口服液的感官评分为(4.685±0.039)%，DPPH·清除率为86.73%。感官评分实际值与预测值的相对误差为0.68%，说明拟合模型优化出的条件较为准确。

2.4 马鲛鱼内脏抗氧化肽口服液成品质量的检测

2.4.1 马鲛鱼内脏抗氧化肽口服液感官指标的检测

马鲛鱼内脏抗氧化肽口服液感官指标检测结果如表6所示。成品呈淡黄色，色泽均匀、清亮自然、澄清透明，不分层，无腥味、无异味，酸甜适中，口感柔和。

表6 马鲛鱼内脏抗氧化肽口服液感官指标检测结果

2.4.2 马鲛鱼内脏抗氧化肽口服液理化指标的检测

马鲛鱼内脏抗氧化肽口服液中的铅和砷含量均符合国家标准，如表7所示。

表7 马鲛鱼内脏抗氧化肽口服液重金属检测结果

2.4.3 马鲛鱼内脏抗氧化肽口服液微生物指标的检测

马鲛鱼内脏抗氧化肽口服液的各项微生物指标均符合国家标准，如表8所示，表8中n为同一批次产品应采集的样品件数；c为最大可允许超出m值的样品件数；m为致病菌指标可接受水平的限量值；M为致病菌指标的最高安全限量值。

表8 马鲛鱼内脏抗氧化肽口服液微生物检测结果

3 结 论

选用活性炭、β-环状糊精和活性干酵母对马鲛鱼内脏抗氧化肽进行脱腥试验，结果表明：活性干酵母的脱腥效果最好。在单因素试验的基础上，采用Design Expert v8.0.6软件的Box-Behnken方法设计响应面试验，建立数学模型。方差分析结果表明影响马鲛鱼内脏抗氧化肽口服液各因素的影响程度从大到小顺序依次为：柠檬酸添加量>蜂蜜添加量>CMC添加量。响应面试验优化后得到马鲛鱼内脏抗氧化肽口服液的最佳配方为：抗氧化肽添加量10%，蜂蜜添加量9.8%，柠檬酸添加量0.11%，CMC添加量0.15%，马鲛鱼内脏抗氧化肽口服液的感官评分为(4.685±0.039)%，DPPH·清除率为86.73%。

对马鲛鱼内脏抗氧化肽口服液的感官、重金属、微生物等各项指标进行检测，结果均符合国家标准。成品呈淡黄色，色泽均匀、清亮自然、澄清透明，不分层，无腥味、无异味，酸甜适中，口感柔和。