细胞如何适应外界变化的氧环境——解读2019年诺贝尔生理学或医学奖*

陈子砚 王予涵 刘可可 王月丹**

（1 北京大学公共卫生学院 北京 100871 2 北京大学附属中学实验学校 北京 100032 3 北京大学基础医学院 北京 100191）

北京时间10月7日，2019年诺贝尔生理学或医学奖在瑞典卡罗林斯卡大学医学院揭晓。美国哈佛大学医学院威廉·凯林（William G.Kaelin Jr.）教授、英国牛津大学彼得·拉特克利夫（Peter J.Ratcliffe） 教授和美国约翰霍普金斯大学医学院格雷格·塞门扎（Gregg L.Semenza）教授共同获得了这一殊荣［1］。

3 位科学家究竟凭借什么研究成果而获得了这个医学研究领域的顶级大奖？这就是对细胞在不同氧气环境中代谢适应调节机制的研究和阐释。细胞在不同氧气环境中代谢适应机制的调节，与人们在生活中的垃圾分类还有几分相似。

1 人类生活在氧气含量不同的环境

人类生活在这个世界上，为了维持机体正常的生理活动，需要不停地消耗氧气，进行能量与物质的代谢。人可1 周不吃饭，3 天不喝水，但时刻都离不开氧气。测量结果表明，人体在正常空气（氧气比例为21%）中，每天需要吸入12 m3的空气，消耗相当于500 L 的氧气，当脑细胞缺氧超过6 min 时，即可因为能量代谢障碍而引起不可逆的死亡。当人体从氧气分压较高的低海拔地区前往高原地区时，有可能发生以头痛、头晕、心慌、气短、气急、恶心、呕吐、乏力、失眠、眼花、嗜睡、手脚麻木、唇指紫绀和心率加快等症状为特征的“高原病”。多数高原病患者可在1 周内逐渐恢复，但少数患者可能会病情恶化，发生高原肺水肿和脑水肿，甚至有致命的风险。

然而，组织中的氧气也会在代谢过程中，产生各种氧自由基等对细胞有损伤作用的物质，这些自由基可损伤细胞膜和线粒体等细胞器，导致细胞的损伤、衰老，甚至死亡。研究表明，动物吸入纯氧后会出现氧中毒的表现，当人类进入一个大气压的纯氧环境中，超过24 h 就会发生氧中毒型肺炎，最终可能会因呼吸衰竭而死亡。与高原病相反，人从氧分压比较低的高原地区到达氧分压较高的平原时，就会出现疲倦、无力、嗜睡、胸闷、头晕和腹泻等症状，人也觉得浑身懒洋洋的，就像喝醉了酒一样，这被称为“低原反应”，俗称“醉氧症”。

不仅如此，在人体内部，不同的组织器官之间也存在着氧气含量的差异。例如，人体肺泡的氧分压为104 mmHg，动脉血氧分压为100 mmHg，组织中氧分压为0 ～30 mmHg，静脉血氧分压为40 mmHg。而缺血时，组织的氧分压可在原有基础上进一步下降。

当发生冠心病和脑梗塞等血管阻塞性疾病时，组织内的含氧量会进一步下降，细胞可能会因缺氧而受损，甚至死亡。另一方面，当阻塞的血管复通后，缺氧组织内的氧气含量急剧增加，又可能造成组织内大量自由基产生，以及钙超载和线粒体损伤等细胞损伤，也可导致组织细胞的死亡。这种现象被称为缺血再灌注损伤。

2 机体和组织细胞对低氧环境的适应及其机制

由于不断面临不同含氧的环境，动物机体和组织细胞必须不断对自身的生理代谢过程进行调节，适应不断变化的氧气环境。例如，人类到了高原后，血液中的红细胞数量和血红蛋白含量会大量增加，提高血液携带氧气的能力，从而在氧气分压较低的环境中，保证人体细胞代谢所需要的氧气供应。

而当血管发生血栓等阻塞性疾病时，缺血组织细胞会调节自身的代谢，降低耗氧量，以适应低氧的环境，而这些组织细胞周围的血管也会不断增生，进入缺血组织，甚至形成侧枝循环，逐渐替代阻塞的血管，满足缺血组织的氧气需要。而在阻塞血管复通之后，组织细胞又会产生大量对抗和清除自由基的物质，并调整细胞代谢以适应高氧的环境。

长期以来，人们一直十分关注机体和组织细胞适应不同含氧环境机制的研究。1957年，Reissman 等采用联体畸形的动物进行缺氧实验研究，发现其中一只动物处于缺氧环境中呼吸而另一只动物处于正常大气中呼吸时，二者体内都会出现同样的骨髓红细胞增生现象。后来，人们在此基础上分离发现了缺氧可促进肾脏产生促红细胞生成素（EPO），拉开了对组织细胞氧环境适应机制研究的大幕。

1992年，美国约翰霍普金斯大学医学院塞门扎教授带领的课题组发现了缺氧诱导因子（hypoxia inducible factor，HIF）及其生理功能［2］。这些发现，极大推动了对细胞如何感受氧气浓度并改变生理代谢功能及其机制的研究。他们的研究结果表明，氧气跟细胞能量代谢密切相关，但氧气对于细胞的作用不只限于提供能量代谢，在生物进化过程中形成的很多生理功能其实都是受到氧气的作用进行调控的［3］。在塞门扎教授1995年发表在PNAS 杂志上的一篇重要相关文献中，排名第一的作者是来自中国的王广良先生。在获悉塞门扎因为发现HIF 而获得2019年诺贝尔生理学暨医学奖后，王广良回顾了当时发现该分子的艰苦经历。据他介绍，当时塞门扎的实验室正在利用给细胞培养箱中输入低浓度氧气的方法模拟低氧环境，通过培养人子宫癌细胞株Hela 细胞，寻找该细胞中能感受氧气浓度下降而调控EPO 基因转录增强的机制。在耗时1年多的研究工作中，他们使用能与活性蛋白结合的EPO 基因增强子序列制成的亲和柱，从几百升细胞悬液中最终得到了几毫克的HIF 蛋白。进一步通过蛋白酶切和测序，根据获得的氨基酸残基序列，塞门扎等推测出HIF的DNA 序列，并制成相应的DNA 序列探针，从人类基因序列库中成功调取到了HIF 基因的序列（图1）。从现代生物技术的角度看，这个工作绝对是一个经典的分子克隆故事。

图1 塞门扎实验室实验流程模式图

在随后对于HIF 的结构与功能研究中，人们发现HIF 家族包括HIF-1、HIF-2 和HIF－3 等多个成员。其中，HIF-1 和HIF-2 具有一定的同源性，均是由α 和β 2 个亚基组成的异源二聚体［9］。其中，HIF-1α 和HIF-2α 是主要的氧调节原件，它们具有的结构均包括螺旋-套-螺旋（bHLH）区、PAS 结构域、氧依赖性降解区（ODD）和激活区（TAD）等结构域。在缺氧环境中，HIF-1α 从细胞质中被转运到细胞核中，通过bHLH 和PAS 结构域与组成性表达的β 亚基（也称为芳香烃受体核转运蛋白，ARNT）相结合，从而调控下游基因的转录与表达，发挥转录活性，可分别参与调节红细胞增殖、新生血管形成、能量代谢和细胞周期与凋亡等重要生理过程（图2）。

图2 HIF-1α 分子结构模式图

HIF 主要通过促进EPO 及其受体的表达和分泌，使骨髓中红细胞的生成增加，提高血液携带氧气的能力，缓解组织细胞的缺氧状态。HIF 可促进血管内皮生长因子（VEGF）、纤维母细胞生长因子（FGF）和转化生长因子β（TGF-β）等与血管和淋巴管生长相关的细胞因子，促进缺氧组织中的血管生成，恢复组织的正常供氧状态。HIF 还可诱导腺苷酸激酶3、烯醇化酶1、1，3，3-磷酸甘油醛脱氢酶、己糖激酶1 和2 等能量代谢相关分子的表达，从而促进糖酵解的过程，弥补在低氧状态下由于呼吸链不能正常运行而减少的ATP，维持细胞在缺氧状态下的生理活动。此外，HIF 还能通过调节P21 和P27等细胞周期依赖激酶抑制分子等的表达及Bcl-2和p53 等凋亡相关分子的表达，参与细胞周期和凋亡的调控。一般认为，在缺氧状态下细胞阻滞在G1期和细胞凋亡的发生，都与HIF 的功能有关。

3 机体和组织细胞在正常氧浓度环境中对于HIF 的调节及其机制

HIF 及其功能的发现，揭示了细胞在低氧和缺氧环境中，通过调节能量代谢和改善氧气供应，进行适应的机制。但是，在正常氧浓度的环境中，细胞又是如何进行能量代谢的调节和适应环境氧气浓度的？彼得·拉特克利夫威廉·凯林的研究工作对这个过程和机制进行了揭示。

有趣的是，人们了解细胞对正常氧气浓度环境的适应机制，首先是从对一种遗传性疾病的研究开始的。1895年，德国眼科医生冯·希佩尔（Von Hippel）发现视网膜血管母细胞瘤具有家族性遗传特征；1926年，瑞典眼科医生林岛（Lindau）进一步观察到，视网膜和小脑血管母细胞瘤不仅是中枢神经系统血管瘤病灶的一部分，而且具有遗传性；1964年，Melmon 和Rosen 在对多篇类似临床病例报告进行总结的基础上，将中枢神经血管母细胞瘤合并肾脏或胰腺囊肿、嗜铬细胞瘤、肾癌及外皮囊腺瘤等疾病，统一命名为“冯·希佩尔-林岛综合征（Von Hippel-Lindau syndrome）”，简称VHL 综合征。研究表明，VHL 综合征是一种常染色体显性遗传病，其主要原因是定位于人类第3 号染色体短臂的VHL 基因发生突变所引起的细胞内分子代谢紊乱。可是，VHL 基因突变导致神经血管瘤发病增加的具体机制，一直都在不断探索之中。

研究发现，在正常氧气条件下，在组织细胞中几乎不含有HIF-1α。但是，当氧气水平大幅下降之后，细胞中的HIF-1α 含量会大量增加，并且进入细胞核，上调EPO 和其他HIF 相关基因的表达，使组织细胞适应低氧环境，减少组织细胞因缺氧而遭受的损伤甚至死亡。其中，威廉·凯林在对VHL 综合征的研究中发现，VHL 基因编码的VHL蛋白是一种抑癌因子，当VHL 基因发生突变后，就会产生功能异常的VHL 蛋白，并使细胞内很多受到HIF 调控的缺氧调节分子（例如，血小板衍生生长因子、VEGF、TGF-α 及EPO 等）大量产生，导致细胞的能量代谢、血管生长、细胞周期、细胞凋亡及炎症反应等许多生理过程发生改变，从而使细胞癌变的风险增加。但是，当凯林将正常的功能性VHL 基因转入VHL 基因突变的肿瘤细胞中时，细胞内的HIF-1α 含量则恢复正常。后续的研究表明，VHL 本质上是一种泛素连接酶，可将靶蛋白分子泛素化，而被泛素化的蛋白质，就会被转运到细胞蛋白酶体中进行降解［4］。因此，VHL 通过给HIF-1α 打上泛素化的标签，从而调控后者在细胞中的降解和代谢，抑制细胞发生癌变。

为了揭示氧气对于VHL 调节HIF-1α 的确切机制，凯林和拉特克利夫带领的课题小组分别进行了进一步的深入研究工作。他们发现在HIF-1α的分子结构中存在着一个富含脯氨酸的氧依赖性降解区（ODD）。当氧气浓度较高时，这个部位的脯氨酸中氢原子经常会与氧气发生反应，发生脯氨酸羟基化，从而具备了被VHL 识别并结合的能力，继而可被泛素化并降解。拉特克利夫还发现了可催化这个过程的关键酶——脯氨酰羟化酶（prolyl hydroxylases，PHD）［5］。HIF-1α 在PHD 的作用下发生脯氨酸羟基化修饰，是VHL 识别并将其泛素化降解的基本条件，但是在缺氧调节下，PHD 的活性急剧下降，甚至失活，导致HIF-1α 的羟基化过程受到抑制，无法被VHL 识别和降解，从而启动受到该分子调控的缺氧相关因子的表达，使细胞发生适应低氧状态的能量代谢变化［6］。

图3 低氧环境与高氧环境下VHL 对HIF-1α 调节机制模式图

4 利用机体和组织细胞氧适应调节的机制治疗疾病

经过塞门扎、凯林和拉特克利夫等人的不断努力，组织细胞适应环境氧气浓度变化的机制终于被阐明。这对于人们利用该机制治疗相关的疾病，具有非常重要的价值。

首先，VHL 蛋白抑癌作用主要是通过调控HIF 的泛素化降解实现的，而HIF-1α 可调控人体约5%的基因表达，这些基因与缺氧下的组织细胞能量代谢改变或缺氧适应有关，其中大多数基因也与肿瘤的发生与发展有关［7］。因此，VHL／HIF-α 通路及其下游调控基因是研发肿瘤治疗药物的重要靶点。目前，人们已经开始借助靶向药物，例如VEGF 的中和性单克隆抗体（贝伐珠单抗）、针对VEGF 和PDGF 受体的小分子抑制剂（例如舒尼替尼、索拉非尼和阿西替尼等）及可抑制HIF 转录的mTOR 酶抑制剂等，阻断HIF 的致癌作用，用于VHL 综合症和肾癌等其他恶性肿瘤的 治 疗［8］。

同时，组织缺氧缺血性疾病也是利用VHL／HIF通路进行治疗的相关疾病。例如，冠心病和脑梗塞的患者，在发生供血不足时，需要通过周围血管的代偿性增生，最终形成侧枝循环，从而替代阻塞的血管，恢复组织细胞的正常供氧。在此过程中，可使用VHL 抑制剂（例如VH-298），减少HIF 的降解，增加VEGF 等促进新生血管形成的细胞因子产生，从而加速缓解组织缺氧的状态，减少心肌或脑细胞的损伤，这对于缓解病情和促进疾病的康复，都具有非常重要的临床价值。

此外，由于VHL/HIF 是调控EPO 生成的重要调节通路，利用该通路治疗红细胞减少等贫血症状，也是非常合理的临床治疗手段。2019年7月，美国著名的医学期刊The New England Journal of Medicine同时在线发表2篇应用小分子低氧诱导因子脯氨酰羟化酶抑制剂罗沙司，治疗慢性肾病透析患者顽固性贫血的III 期临床试验研究及其结果，证实该药在治疗顽固性贫血中具有良好的疗效。目前，罗沙司他作为一种作用机制创新的贫血治疗药物，已分别在中国和日本获得批准上市。

由此可见，对于VHL／HIF 在细胞氧环境适应调节中的作用及其机制研究，不仅推动了组织细胞能量代谢调节作用的基础研究，而且对于治疗恶性肿瘤、心脑血管疾病和顽固性肾性贫血等重大人类疾病，都具有十分重要的临床价值，有利于改善这些患者的治疗效果及其预后。因此，凯林、拉特克利夫和塞门扎等3 人作为揭示组织细胞氧环境适应分子机制的发现者，获得2019年诺贝尔生理学暨医学奖，是当之无愧的。