2种方法提取绒毛香茶菜精油成分及体外抗氧化能力的比较研究*

杨晓娜 张星和 杨丽华 宋志姣 李晓娇 侯洪波

（保山学院资源与环境学院 云南保山 678000）

精油是从植物的花、叶、茎、根或果实中，通过水蒸气蒸馏法、挤压法、冷浸法或溶剂提取法提炼萃取的挥发性芳香物质的总称［1］。化学成分较为复杂，一般都具有抑菌、抗炎、抗氧化、杀虫等多种生物活性［2］。绒毛香茶菜（Plectranthus hadiensisvar.tomentosus），唇形科香茶菜属，多年生灌木状草本植物，又因其香味浓甜，颇似苹果香味，故又享有“苹果香”美誉［3］。

目前，国内、外对绒毛香茶菜的研究集中在植物化学［3-6］、抑菌［7-8］、栽培［9-10］及生理［11-13］等方面。经查阅文献，尚未检索到有关不同提取方法提取的绒毛香茶菜精油成分测定及其抗氧化活性的比较研究。本文用GC-MS 分别对微波辅助水蒸气蒸馏法和超声波辅助水蒸气蒸馏法获得的精油进行化学成分分析，比较不同提取方法下绒毛香茶菜精油成分的差异和体外抗氧化能力的差异。一方面为弄清其生理功能，从而为进行有效提取分离纯化技术的研究奠定基础；另一方面，比较精油成分的差异，为进一步对精油活性研究比较提供理论依据和技术支持。同时，加速植物药用资源的有效开发利用，为挥发精油在医药、食品工业中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 新鲜绒毛香茶菜全株（月龄3～5 个月，根茎部未木质化），采购于江苏省宿迁市沭阳县梦溪园艺植物园。

DPPH（美国Sigma 公司）、ABTS 分析纯（美国Sigma 公司）、Tris（美国Amresco 公司）、连苯三酚（国药集团化学试剂有限公司）等；所有有机溶剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备 Trace DSQ GC-MS（赛默飞世尔科技有限公司）、SB-3200DT 超声波清洗机（宁波新芝生物科技有限公司）、G70F20N2L-DG（S0）微波炉（广东格兰仕微波炉电器制造有限公司）、DZTW 型调温电热套（北京市光明医疗仪器有限公司）及XBLL-25A 匀浆机（上海帅佳电子科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 2种提取绒毛香茶菜精油的方法 1）微波辅助水蒸气蒸馏法：称取一定量的绒毛香茶菜鲜叶，料液比为1∶6（g／mL），匀浆至流体状（即无大颗粒样品），浸泡1 h 后，将预处理好的样品填充至蒸馏瓶中。微波炉中调至252 W 进行2 min微波处理，加入几粒沸石或小玻璃珠，蒸馏3～4 h，至精油馏量不再增加，收集油水分离器中上层的油层，得到具有特殊香气的精油，用无水硫酸钠干燥后于-20℃密封保存。提取过程重复操作3 次。计算该方法的精油提取率，即精油质量与样品质量的比值。2）超声波辅助水蒸气蒸馏法：精油富集、保存等操作与微波水蒸气蒸馏法操作相同。不同在于后者是超声波180 W 调至30℃进行20 min超声处理。

1.3.2 绒毛香茶菜精油的GC-MS 分析方法GC 条件：色谱柱：DB-17 型石英毛细柱管（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；升温程序：起始50℃，保持5 min，5℃／min 升温至90℃，20℃／min 升温至120℃，保持1 min，10℃／min 升温至210℃，保持5 min，10℃／min 升温至240℃，40℃／min 升温至280℃，保持5 min；载气：He；进样口温度：230℃；进样流量：1.0 mL／min。

MS 条件：离子源：EI；电离能：70 eV；离子源温度：200℃；扫描质量范围（m／z）：20～500 amu。质谱库：NIST05s.LIB 和NIST05.LIB 谱库。

1.3.3 绒毛香茶菜精油体外抗氧化能力的测定方法

1.3.3.1 DPPH 自由基清除法 参照Ahmad N.等［14］的方法，取相同体积的样品溶液和0.2 mmol／L的DPPH 溶液2 mL，混匀反应30 min；以无水乙醇作对照，测定517 nm 处的吸光值A；同样测定2 mL样品溶液与2 mL 无水乙醇混合液在517 nm 处的吸光值A0；再测定2 mL DPPH 溶液与2 mL 无水乙醇混合液在517 nm 处的吸光值A1（重复3 次）；计算清除率：清除率=［1-（A-A0）／A1］×100%。

1.3.3.2 ABTS 自由基清除法 参照Delgado-Andrade 等［15］的方法，用无水乙醇配制不同质量浓度的精油，使得VC 配制的溶液浓度和精油的浓度一致。取0.1 mL 样品溶液，加入3.9 mL ABTS 自由基溶液，在734 nm 处测其吸光值A；再取0.1 mL无水乙醇溶液，加入3.9 mL ABTS 自由基溶液，同上测定其在734 nm 处的吸光值A0（重复3 次）；计算清除率：清除率=［（A0-A）／A0］×100%。

1.3.3.3 超氧阴离子自由基清除法 参照李熙灿的方法［16］，用无水乙醇配制不同质量浓度的精油，使得VC 配制的溶液浓度和精油的一致。取2 950 μL Tris-HCl 缓冲液加入到石英比色皿中，再添加50 μL 连苯三酚溶液，迅速混合，开始计时，每隔30 s 在325 nm 处读数一次A值，至300 s为止，其中空白参比为Tris-HCl 缓冲液。计算得ΔA0=A325nm，300s～A325nm，30s。取50 μL 样品溶液加入到比色皿中，再添加2 900 μL Tris-HCl 缓冲液，再添加50 μL 连苯三酚溶液，迅速混合（颠覆式），开始计时，每隔30 s 在325 nm 处读数一次A值，至300 s 时为止，其中空白参比为Tris-HCl 缓冲液。计算得ΔA=A325nm，300s～A325nm，30s。对照样品VC溶液重复样品测量操作。计算清除率：清除率=［（ΔA0-ΔA）／ΔA0］×100%。

2 结果与分析

2.1 2种方法提取绒毛香茶菜精油的提取率比较分析 微波辅助水蒸气蒸馏法和超声波辅助水蒸气蒸馏法对绒毛香茶菜精油的提取均具有可行性。从提取率分析，微波辅助水蒸气蒸馏法效率较高为0.56%，超声波辅助水蒸气蒸馏法为0.47%。由于超声波的空化效应、机械效应和热效应及微波的电磁场作用影响，对植物细胞内含物的释放具有促进作用。

2.2 微波辅助水蒸气蒸馏法法提取的绒毛香茶菜精油成分分析 微波辅助水蒸气蒸馏法法提取的绒毛香茶菜精油GC-MS 总离子色谱图见图1。经过GC-MS 分析微波辅助水蒸气蒸馏法提取的绒毛香茶菜精油成分共有65 种，其中4-羟基-4-甲基-2-戊酮（23.23%）相对含量最高，其次是D-柠檬烯（14.98%）、Podocarp-7-en-3β-ol、13β-methyl-13-vinyl-（13.62%）和α-萜品烯（6.06%）。

图1 微波辅助水蒸气蒸馏法提取的绒毛香茶菜精油GC-MS 总离子色谱图

2.3 超声波法提取的绒毛香茶菜精油成分分析超声波辅助水蒸气蒸馏法提取的绒毛香茶菜精油GC-MS 总离子色谱图见图2。经过GC-MS 分析超声波辅助水蒸气蒸馏法提取的绒毛香茶菜精油成分共有6 种，其中4-羟基-4-甲基-2-戊酮（42.53%）相对含量最高，其次是柠檬烯（39.17%）、萜品油烯（14.31%）和间异丙基甲苯（2.21%）。

图2 超声波辅助水蒸气蒸馏法提取的绒毛香茶菜精油GC-MS 总离子色谱图

2.4 2种方法提取的绒毛香茶菜精油成分分析比较分析 如表1所示，可知2 种方法提取的绒毛香茶菜精油成分中主要为烯烃类与酮类，其中烯烃类化合物成分，超声波辅助水蒸气蒸馏法提取的绒毛香茶菜精油（54.3%），微波辅助水蒸气蒸馏法提取的绒毛香茶菜精油（39.2%）；酮类化合物成分超声波辅助水蒸气蒸馏法提取的绒毛香茶菜精油占比最高（42.53%），微波辅助水蒸气蒸馏法提取的绒毛香茶菜精油（27.78%）。2 种方法提取的绒毛香茶菜精油成分中，微波辅助水蒸气蒸馏法提取的绒毛香茶菜精油包含化合物种类最多，其次是超声波辅助水蒸气蒸馏法提取的绒毛香茶菜精油。

表1 2 种方法提取的绒毛香茶菜精油成分分类比较

2.5 2种方法提取的绒毛香茶菜精油体外抗氧化能力分析

2.5.1 2种方法提取的绒毛香茶菜精油对DPPH自由基清除率比较 实验中样品共设置5 个浓度梯度即（200～1 000）μg／mL，由图3可知，2 种方法提取的绒毛香茶菜精油溶液对DPPH 自由基清除率均未超过VC 阳性对照组（浓度梯度内清除率为90.78%～91.94%）。其中超声波辅助水蒸气蒸馏法组精油DPPH 自由基清除力（浓度梯度内清除率为71.38%～81.78%）优于微波辅助水蒸气蒸馏法组精油（浓度梯度内清除率为72.17%～75.34%）。

图3 2 种方法提取的绒毛香茶菜精油和VC 对DPPH 自由基清除率

2.5.2 2种方法提取的绒毛香茶菜精油对ABTS自由基清除率比较 实验中样品共设置5 个浓度梯度即（200～1 000）μg／mL，由图4可知，2 种方法提取的绒毛香茶菜精油溶液对ABTS 自由基清除率均未超过VC 阳性对照组（浓度梯度内清除率为95.32%～99.69%）。其中超声波辅助水蒸气蒸馏法组精油ABTS 自由基清除力（浓度梯度内清除率为55.79%～98.55%）优于微波辅助水蒸气蒸馏法组精油（浓度梯度内清除率为45.92%～52.63%）。

图4 2 种方法提取的绒毛香茶菜精油对ABTS 自由基清除率

2.5.3 2 种方法提取的绒毛香茶菜精油对超氧阴离子自由基清除率比较 实验中样品共设置5 个浓度梯度即（200～1 000）μg／mL，由图5可知，微波辅助水蒸气蒸馏法提取的绒毛香茶菜精油溶液对超氧阴离子自由基清除率在（600～1 000）μg／mL 浓度区间超过VC 阳性对照组（浓度梯度内清除率为92.46%～100.00%）。其中微波辅助水蒸气蒸馏法组精油超氧阴离子自由基清除力（浓度梯度内清除率为81.24%～100.00%）优于超声波辅助水蒸气蒸馏法组精油（浓度梯度内清除率为72.70%～83.82%）。

图5 2 种方法提取的绒毛香茶菜精油对超氧阴离子自由基清除率

2.5.4 2种方法提取的绒毛香茶菜精油抗氧化活性比较分析 通过比较2 种方法提取的绒毛香茶菜精油在不同抗氧化体系下的抗氧化活性可知，绒毛香茶菜精油在（200～1 000）μg／mL 浓度梯度范围内对DPPH 自由基、ABTS 自由基和超氧阴离子的清除率均随着浓度的增加而增加。精油是各种挥发性化学成分的混合物，清除自由基的能力是各种化学成分综合作用的结果。黄酮类、萜类、有机酸等物质是抗氧化的有效成分，且具有较好的金属离子的能力。绒毛香茶菜精油的主要成分是烯烃类和酮类，可推测烯烃类和酮类化合物及其衍生物在不同抗氧化体系下具有显著的抗氧化作用。之所以出现不同方法提取的精油在不同的抗氧化能力评价体系中存在差异，正因为不同方法提取的精油组分不同，不同组分的抗氧化活性不同。

3 讨论

在成分方面，本实验由GC-MS 测试结果显示绒毛香茶菜精油主要成分为烯烃类及酮类，其中采用水蒸汽蒸馏法提取得到的精油柠檬烯（36.64%）相对含量最高，与赵小珍等［3］的研究结果相似；但分别采用微波和超声波辅助水蒸汽蒸馏法得到的精油主要成分为4-羟基-4-甲基-2-戊酮，且成分种类多于水蒸汽蒸馏法得到的精油，推测主要原因是辅助提取手段对细胞的破壁作用所导致。同样的现象出现在薛山［17］对不同提取方法下紫苏叶精油成分组成研究中及赵海伊等［18］对3 种不同方法提取牛至挥发精油的化学成分比较研究中。

在抗氧化活性方面，对绒毛香茶菜精油抗氧化活性的研究少有报道。实验中微波辅助水蒸气蒸馏法提取的绒毛香茶菜精油溶液对超氧阴离子自由基清除率在（600～1 000）μg／mL 浓度区间超过VC 阳性对照组（浓度梯度内清除率为92.46%～100.00%）。对比薛山［17］不同提取方法下紫苏叶精油抗氧化功效研究同样出现实验组抗氧化活性超过VC 阳性对照组的现象，推测其较高的抗氧化活性可能得益于绒毛香茶菜精油中较高含量的烯、醇类物质。

4 结论

从提取率来看，微波辅助水蒸气蒸馏法要优于超声波辅助水蒸气蒸馏法，提取率达到0.56%。由GC-MS 测试结果显示，绒毛香茶菜精油主要成分为烯烃类及酮类，2 种方法提取的绒毛香茶菜精油成分中4-羟基-4-甲基-2-戊酮最多（相对含量在23.23%～42.53%之间），其次是α-萜品烯、萜品油烯、双戊烯和D-柠檬烯。但在，2 种提取法得到精油成分中组分及含量均存在一定差异。在不同的抗氧化能力评价体系中证实，2 种方法提取的绒毛香茶菜精油在（200～1 000）μg／mL浓度梯度范围内均有较强的抗氧化活性，且与精油浓度梯度成正相关。