HMGB1 及其受体RAGE 在桥本甲状腺炎患者中的变化及临床意义*

饶欢欢，华琳，刘晓峰，温洪周，薛国辉

（江西省九江市第一人民医院检验科，九江332000）

桥本甲状腺炎（hashimoto’s thyroiditis，HT）是一类最常见的自身免疫性甲状腺疾病， 其主要病因学为甲状腺功能减退[1]。 而其特征为血清甲状腺过氧化物酶抗体（thyroperoxidase antibody，TPOAb)和甲状腺球蛋白抗体 （thyroglobulin antibody，TgAb）异常升高[2]。 虽有研究报道发现遗传易感性和环境因素参与本病的发生发展， 但至今其详尽的发病机制尚不清楚[3]。 既往研究证实HT 患者甲状腺组织中浸润淋巴细胞， 尤其是辅助性T 细胞17（T helper cell 17, Th17），这些炎性细胞浸润会引起甲状腺滤泡破坏， 此外外周血中也发现Th17细胞上调而调节性T 细胞（Regulatory cells, Treg）细胞显著下调[4,5]。 Th17/Treg 轴平衡对于维持机体免疫稳态至关重要，已在多种自身免疫性疾病中发现其存在异常， 据此推测Th17/Treg 轴紊乱在HT中扮演重要角色。但何种分子参与调控HT 中这一紊乱并不清楚。 高迁移率族蛋白B1（high-mobility group box 1，HMGB1）与其受体晚期糖基化终产物受体 （receptor for advanced glycation endproducts，RAGE）结合共同作用参与免疫系统调控，其中比较重要的即为参与Th17/Treg 轴调控[6]，已有报道其在系统性红斑狼疮和类风湿性关节炎等疾病中异常表达[7]，但其是否在HT 患者中发生变化且是否与Th17/Treg 存在关联，目前未见相关报道。 据此，本研究将检测HT 患者HMGB1 和RAGE 表达变化及其与Th17 和Treg 效应细胞因子IL-17、IL-10 表达的相关性。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选取2018 年3 月至2019 年12 月间于九江市第一人民医院内分泌科就诊且明确诊断为HT 的初诊患者35 例，其中女27 例，男8 例。所有HT 患者均为门诊患者，诊断依据甲状腺彩色多普勒超声和血清TPOAb 和TgAb，参考中华医学会内分泌学分会制定的 “成人甲状腺功能减退症诊治指南”[8]。 排除标准：⑴合并其他自身免疫性疾病；⑵合并肿瘤；⑶合并慢性肾脏病、糖尿病和感染性疾病； ⑷就诊前3 个月内使用影响甲状腺功能或免疫系统的药物；妊娠期或哺乳期女性患者。同时选取30 例同期健康体检人群作为本研究对照组，其中女24 例，男6 例，健康人群除满足以上排除标准，还应排除甲状腺疾病。

1.2 血液标本采集和处理 采集35 例HT 患者和30 例体检人群入院当日空腹静脉血6ml，分装于2个干燥管中,每管3ml,室温静置20min 后，3000rmp 15min 离心分离血清。 其中一管立即送检，用于甲状腺功能五项测定。另一管分离血清,冻存至-80℃,用于酶联免疫吸附试验测定血清HMGB1、RAGE、IL-17 和IL-10 的测定。

1.3 甲状腺功能五项测定 采用罗氏combas e601全自动电化学发光仪及配套试剂测定血清FT3、FT4、TSH、TPOAb 和TgAb 浓度。 各指标参考范围如下：FT3：3.1-6.8pmol/L，FT4：11.48-22.70pmol/L，TSH：0.20-7.0μIU/L，TPOAb：0-34 IU/mL，TgAb：0-115 IU/mL。 检验前保证仪器室内质量控制在控。

1.4 血清HMGB1、RAGE、IL-17 和IL-10 测定 血清HMGB1、RAGE、IL-17 和IL-10 均采用酶联免疫吸附试验测定。 Human HMGB1 ELISA Kit(DEIA6297)、Human RAGE ELISA Kit (DEIA2687)、Human IL-17 ELISA Kit (DEIA7983)和Human IL-10 ELISA Kit (DEIA116) 均购自美国Creative Diagnostics 公司， 分别用于血清HMGB1、RAGE、IL-17 和IL-10 测定。 所有实验步骤严格依据试剂盒说明书执行。

1.5 统计学分析 所有实验数据采用SPSS 25.0 软件分析，计量资料采用均数±标准差（±s）形式表示，组间差异采用独立样本t 检验。 指标间相关性采用Spearman 法进行分析。以P＜0.05 视为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HT 患者和对照组一般资料比较 与健康对照组相比，HT 患者具有更低水平的TSH， 以及更高水平的TPOAb 和TgAb。而两组间年龄、性别构成、BMI、FT3 和FT4 间差异均无统计学意义。 见表1。

表1 HT 患者和对照组一般资料比较

2.2 HT 患者和对照组血清HMGB1、RAGE、IL-17和IL-10 比较 与健康对照组相比，HT 患者HMGB1 和RAGE 均显著上调, 差异具有统计学意义（P＜0.05）。此外，HT 患者血清IL-17 水平亦显著高于对照组， 而IL-10 则显著低于健康对照组（P均＜0.05）。 见表2。

表2 HT 患者和对照组血清HMGB1、RAGE、IL-17 和IL-10 比较

2.3 HT 患 者 血 清HMGB1 和RAGE 与TSH、TPOAb、TgAb、IL-17 和IL-10 的 相 关 性 分 析Spearman 相关性分析发现，HT 患者血清HMGB1与TSH、TPOAb 和TgAb 间相关性并不显著， 而与IL-17 浓度呈显著正相关性，而与IL-10 水平呈显著负相关性。 而血清RAGE 与TSH、TPOAb、TgAb和IL-10 间均无显著相关关系，而与IL-17 呈显著正相关关系。 见表3。

3 讨论

既往研究表明HT 发病机理与免疫平衡紊乱相关, 其中CD4+T 细胞活化被认为扮演重要角色[9]。 Th17 细胞是CD4+T 细胞中一类在炎症反应中极为关键的亚群， 已有大量研究证实其在多种自身免疫性疾病中通过分泌IL-17 发挥促炎生物学效应。 Th17 可通过IL-17 诱导自身反应性生发中心形成以及自身抗体的分泌[10]。 因此，Th17 可能也参与了自身抗体分泌过量的HT 发生过程，在小鼠模型中，Th17 相关免疫反应确实对于碘诱导的自身免疫性甲状腺炎的发展必不可少[11]。 在HT 患者中，本研究亦发现了IL-17 细胞因子相较对照组显著上调，这与J Gerenova 等[12]的研究结果一致。 这些结果进一步提示Th17 细胞及相关细胞因子参与了HT 的发展过程，但具体调控机制有待深入研究。 此外，Treg 细胞作为重要的免疫负调控CD4+T细胞亚群，在自身免疫性疾病中已经得以证实，其可通过分泌IL-10 效应细胞因子维持自身耐受性并阻止自身免疫反应[13]。 在HT 中，当去除Treg 细胞后，自身免疫性甲状腺炎耐受的NOD.H-2h4 小鼠会变得对自身免疫甲状腺炎极为敏感[14]。而本研究利用HT 患者发现IL-10 显著下降，这些研究表明Treg 细胞及其效应细胞因子在HT 发生发展中可能扮演保护作用。 Th17 和Treg 构成了HT 免疫失衡中重要的作用轴， 而这一平衡轴紊乱的调控机理并不清楚。

表3 HT 患者血 清HMGB1 和RAGE 与TSH、TPOAb、TgAb、IL-17、IL-10 的相关性

HMGB1 是一类免疫调控分子，其可在炎症反应刺激时被单核细胞分泌而作为损伤相关模式识别受体分子[15]。HMGB1 受体为RAGE，既往研究证实两者结合可在免疫和炎症过程中抑制Treg 细胞反应而促进Th17 细胞反应[16]。 Li J.等在乙肝患者中发现高表达的HMGB1 可扭转Th17/Treg 平衡，导致Th17 占据主导地位，而Treg 被削弱，进而加速肝脏损伤和炎症反应[17]。 而关于其是否与HT 患者中异常的Th17/Treg 存在关联， 目前并不清楚。在本研究中，我们发现HMGB1 和RAGE 在HT 患者中均显著上调， 提示其可能作为HT 生物标志物， 这在未来研究中有必要进步一扩大样本量进行验证。 进一步相关性分析发现，HT 患者血清HMGB1 与血清IL-17 和IL-10 均存在显著相关性，这在一定程度上提示HMGB1 可能参与了异常Th17 和Treg 平衡紊乱。 而这有必要在将来研究中在体外细胞实验和动物模型中利用基因敲除进一步证实。Jia-wang Ding 等[18]在动脉粥样硬化患者中发现HMGB1 与Th17 显著正相关，而与Treg 细胞呈显著负相关关系，这与本研究结果类似。 此外，本研究还评价了受体RAGE 与IL-17 和IL-10 的关系， 结果发现RAGE 仅与IL-10 呈显著负相关性，这可能是因为HMGB1 发挥免疫负调控效应可能并不完全是通过RAGE 受体实现， 如既往研究发现HMGB1 除了与RAGE 受体作用外还可以与TLR-2 和TLR-4 受体结合通过多通路参与巨噬细胞等活化过程，进而促进下游信号激活，诱导包括促炎细胞因子的分泌和T 细胞的活化[19]。这也部分解释了RAGE 仅与IL-10 相关，而与IL-17 不相关的结果。 本研究还存在一定的不足之处，主要为：⑴未测定外周血Th17 和Treg 细胞频率，而仅测定效应细胞因子水平； ⑵样本量相对较小， 若验证HMGB1 生物标志物作用需要多中心大样本量。

总之，本研究初步发现HT 患者存在异常上调的HMGB1 和RAGE，而其又与IL-17 和IL-10 存在显著相关性， 提示HMGB1 可能通过调控Th17/Treg 进而参与HT 的发生发展过程。