阿尔茨海默病小鼠海马组织差异表达miRNA-687的生物信息学分析

吴俊 张颖

(江苏省疾病预防控制中心毒理与风险评估研究所，江苏 南京 210009)

阿尔茨海默病(AD)是一种以进行性认知障碍、记忆力损害和精神行为异常为主的中枢神经系统退行性病变〔1〕。我国的人口老龄化导致AD患者数目增长迅速，我国每7 s就有一个人患上AD，平均生存期仅有5.9年〔2〕。AD的发病机制复杂且尚不明确，文献报道，包括β-淀粉样蛋白假说、“Tau蛋白”假说在内的多种机制研究〔3,4〕。MicroRNA是一类长度为19～25个核苷酸的小分子RNA。研究发现microRNA与AD的发生和发展有密切联系，microRNA可能通过直接或间接调节β-淀粉样蛋白代谢、轴突可塑性等方式参与其中〔5,6〕。随着现代生物技术的迅速发展如基因芯片等，为全面研究AD发生的分子机制提供了新手段。本研究应用生物信息学方法分析AD模型小鼠海马组织差异表达的相关microRNA，并以其中一个microRNA为靶点，挖掘其可能参与的调控机制，为进一步阐明AD发生的分子机制提供新的研究线索。

1 材料与方法

1.1材料 从美国国立生物技术信号中心(NCBI)公共数据平台GEO检索“Alzheimer′s disease〔All Fields〕AND microRNA〔All Fields〕AND Hippocampus〔All Fields〕”，选择物种为小鼠，并下载基因芯片数据集GSE48028。GSE48028包含来源于6只AD模型小鼠和6只对照小鼠双侧海马组织标本差异表达的microRNA信息。

1.2microRNA筛选及数据处理 使用GEO2R在线工具分析和查找差异表达的microRNA，以|Log FC|>1.5和P<0.05对数据进行标准化处理。

1.3靶基因预测 采用TargetScan7.2靶基因预测工具和miRDB在线靶基因预测网站，选择物种为小鼠，输入miRNA-687运行后导出该microRNA的靶基因预测结果，并把2个靶基因预测工具预测出的靶基因取交集。

1.4富集分析(GO)和通路分析(KEGG) DAVID是一个在线生物信息数据库，其中GO用于注释基因生物学过程，KEGG用于预测其相关信号通路。利用DAVID数据库，以小鼠基因组数据为背景，从生物学过程、细胞组分和分子功能3方面富集并分析上述预测得到的靶基因，并利用KEGG功能进行分析。应用R软件3.5.3版对分析结果进行整理。

1.5靶基因相互作用网络分析 蛋白质相互作用网络预测将miRNA-687的靶基因导入STRING在线分析网站，设置可信度为0.4则认为具有统计学意义，得出其靶基因编码蛋白之间相互作用网络图。Cytoscape3.7.1软件用于可视化分子相互作用网络，分析网络内靶基因编码蛋白的连通度。以degree cutoff =2，node score cutoff =0.2，k-core =2，max.Depth=100为标准，利用Cytoscape内的MCODE插件对互作网络进行评分，得出评分表较高的蛋白质互作网络，找出关键靶基因。使用在线Uniprot数据库对互作节点度≥4的靶基因进行功能分析。

2 结 果

2.1筛选出差异表达的microRNA 计算模型组和对照组样本间|Log FC|和P值，筛选出下调microRNA共8个：miRNA-693-5p、miRNA-707、miRNA-679、miRNA-878-3p、miRNA-701、miRNA-465c-5p、miRNA-878-5p、miRNA-687，上调microRNA共4个：miRNA-376a、miRNA-362-3p、miRNA-455、miRNA-883a-5p，见表1。

表1 差异表达的microRNA筛选结果

2.2miRNA-687的靶基因预测 miRNA-687被认为是肾缺血再灌注损伤的关键调节因子和治疗靶点，但对其在神经系统方向及更为深入的相关机制和功能研究报道很少，本文选择miRNA-687作为研究对象预测其靶基因，为进一步研究miRNA-687的机制和功能提供线索。利用TargetScan靶基因预测工具发现miRNA-687的靶基因2 137个，miRBase在线预测网站预测靶基因230个，对2种工具预测出的靶基因取交集得到172个共同的靶基因，Peg10，Sos2，Atp11c，Irx2，Paqr8，Pde3b，Homer1，Cpeb3，Usp53，Hormad2，Dcaf12l2，Vps26b，Slc24a2，Cyp7b1，Suds3，Plekho1，Slc2a4，Met，Ninj2，Sstr1，Adam10，Mycbp2，Sfrp4，Ascl2，Dennd5b，Scarb2，Klf12，Exph5，Ptpn12，Crls1，Cherp，Dld Prr7，span2，Rasl11b，P2ry13，Flvcr2，Six3，Iqsec1，Vax1，Nufip2，Naa15，Tbx20，Pus1，Fam168b，Riok3，St8sia4，Fbxo28，Htr7，Pten，Prmt3，Luzp1，Clock，Itln1，Fuca2，Pex5l，Sept7，Kif2a，Ankrd9，Fgfbp1，Nid1，Ccser1，Fut9，Cdh6，B3gat1，Tmtc4，Plxnb1，Map3k1，Rnf138，Nfya，Ppm1e，L2hgdh，Ywhaz，Cxadr，Nol4，Vps28，Dido1，Fam84b，Tmed7，Twistnb，Gfm1，Tmx1，Srsf10，Sgpp2，Igsf1，Gpc6，Tnfsf4，Krtap26-1，Rassf5，Lrba，Tlk1，Pias2，Chic1，Cebpg，Tram1l1，Msl2，Kcnd3，Abi1，Atxn1l，Tapt1，Eva1a，Six1，Ctxn3，Ptges3，Aspn，Gm2a，Zkscan8，Clic5，Slc30a9，Pdcd6ip，Prkca，Bcar3，Mak16，Ubox5，Maml2，Nrl，Amacr，Ldha，Nlrc5，Was，Anxa3，Ska3，Grip1，Ficd，Pcyox1，Syap1，Nr4a3，Srgn，Sin3a，Tm2d2，Dennd6a，Ranbp3l，Rp1，Mars2，Fgf20，Cadm2，Arhgef38，Clec7a，Insr，Pank3，Gtf2a1，Bag4，Col19a1，Camk4，Vps33b，Tmx4，Mtcp1，Megf9，Gpr161，Rap2c，Igfbp4，Tdrd6，Tctex1d1，Sdhd，Zscan22，Rrm2b，Itga4，Slain2，Ppp1r16b，4-Mar，Rarb，Fance，Itgb1bp2，Tmem130，Metap2，Serpinb8，Nfib，Mthfr，Stk3，Sp1，Trpm3，Arfgef1，Rora。

2.3miRNA-687靶基因的GO和KEGG 通过GO靶基因的主要生物学过程、分子功能及细胞组件，整理了排名前十位且差异有统计学意义的结果，发现其们主要参与了RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控、凋亡过程、树突棘形态发生、DNA转录正调控、细胞增殖负调控等生物学过程；分子功能包括蛋白结合作用、核心启动子序列特异性DNA结合、调节转录因子活性、调节鸟苷核苷酸交换因子活性等功能；而细胞组成分析显示这些基因大多集中在投射神经元、再循环内体、突触等区域。见图1。

图1 miRNA-687靶基因的GO

KEGG结果显示，差异有统计学意义的信号通路包括：(1)PI3K-Akt信号通路(mmu04151)，该通路由9个miRNA-687的靶基因参与，分别为Prkca、Ywhaz、Sos2、Met、Mtcp1、Itga4、Fgf20、Pten、Insr。(2)非小细胞肺癌(mmu05223)，该通路由4个靶基因参与，分别为Prkca、Rassf5、Sos2、Rarb。(3)Ras信号通路(mmu04014)，该通路由7个靶基因参与，分别为Prkca、Rassf5、Htr7、Sos2、Met、Fgf20、Insr。(4)FoxO信号通路(mmu04068)，该通路由5个靶基因参与，分别为Slc2a4、Sos2、Homer1、Pten、Insr。

2.4miRNA-687靶基因相互作用网络分析 利用STRING数据库分析得到网络关系如，显示172个节点之间存在82种关系，其中Suds3与Sin3a、Abi1与Was、Clock与Rora、Mak16与Twistnb、Fuca2与Gm2a、Met与Plxnb1、Grip1与Prkca、Gtf2a1与Sp1、Adam10与Rap2c、B3gat1与Gpc6这十对基因之间的联系最为密切。插件MCODE分析后发现符合参数要求的有3个子模块，第1、2个子模块分别由4个节点和6条边组成，第3个子模块由3个节点和3条边组成，Pten、Met、Insr、Ptpn12、Fuca2、Eva1a、Adam10、Igfbp4这8个靶基因在蛋白质互作网络中起关键作用，是受miRNA-687调节的关键基因。

3 讨 论

AD是老年人最常见的中枢神经系统退行性疾病，以β-淀粉样蛋白沉积形成的老年斑、tau蛋白过度磷酸化形成神经原纤维缠结及大量神经元死亡为病理特征。现已明确，microRNA可与靶基因mRNA的3′非编码区特异性结合，负向调控靶基因的转录后水平，参与细胞的增殖、分化、凋亡等多种生物学过程〔7〕。基因调控与AD的发生发展有密切联系。研究显示microRNA与β-淀粉样蛋白致AD的机制有关，如在AD小鼠模型中，上调的miR-331-3p可通过调控靶基因的表达引起β-淀粉样蛋白升高〔8〕。此外，microRNA与tau蛋白的磷酸化密切相关，Dickson等〔9〕发现晚期AD患者富集tau蛋白的脑组织中miRNA-512的表达降低，研究进一步发现miRNA-512通过靶向细胞型Fas相关死亡区域的β白细胞介素(IL)-1转换酶抑制蛋白从而负调控tau蛋白表达。

miRNA-687位于小鼠的第14号染色体上，关于miRNA-687的研究主要集中于急性肾损伤方面〔10〕。有文献报道miRNA-687在肾缺血再灌注小鼠肾脏组织和缺氧状态下的肾脏细胞中表达上调〔11〕。miRNA-687抑制了磷酸酶张力蛋白同系物基因Pten的表达从而促进了细胞周期进展和凋亡。而其在神经系统方面及更为深入的相关机制和功能研究报道很少，通过靶基因预测、GO、KEGG，更好地探讨miRNA-687的分子机制和生物学功能。综合GO结果可以推测，miRNA-687可能通过调控集中于投射神经元、再循环内体、突触等区域的靶基因调控RNA聚合酶Ⅱ启动子转录、参与细胞凋亡、调节树突棘形态发生等生物学过程影响AD的发生发展。KEGG提示miRNA-687靶基因集中于PI3K-Akt、Ras等信号通路。内质网应激与AD患者神经元死亡有关，而Pten抑制剂可以通过激活APP/PS1转基因AD模型小鼠的PI3K/AKT信号通路来抑制内质网应激从而起到神经保护作用〔12〕。此外，淀粉样前体蛋白可激活Ras信号通路从而促进了神经退行性疾病的发生〔13〕。

STRING在线分析网站和Cytoscape软件预测Pten、Met、Insr、Ptpn12、Fuca2、Eva1a、Adam10、Igfbp4这8个靶基因受miRNA-687调节的关键基因。磷酸酶及张力蛋白同源基因Pten定位于染色体10q23.3，由9个外显子组成，编码由403个氨基酸组成的蛋白质，具有磷酸酯酶活性。除上述Pten抑制剂通过PI3K/AKT信号通路来抑制内质网应激外，Pten能有效避免AD模型中突触功能失常和认知功能缺陷〔14〕。Met是受体型酪氨酸激酶RTK家族成员之一，其配体为间质起源的细胞产生的肝细胞生长因子Hgf，二者结合组成Met/Hgf信号系统参与葡萄糖代谢、细胞增殖、神经保护和神经再生〔15〕，在AD患者脑组织海马神经元中Met的表达呈下降趋势，这种下降可能对AD患者神经元的存活产生不利影响。AD的主要病理特征包括脑内毒性β-淀粉样蛋白沉积和神经元大量消失死亡。而β-淀粉样蛋白是由淀粉样前体蛋白APP 降解而来。Adam10属于Ⅰ类单个跨膜蛋白，促进其向细胞的转运及过表达能够加强对APP的降解。临床上细胞α分泌酶可用于治疗AD患者，而Adam10不仅可以作为主要的α分泌酶，还可以通过与底物的相互作用影响Tau蛋白、突触功能、海马神经发生和胶质生成〔16〕。上述研究均为miRNA-687及受其调节的靶基因作为AD研究的新靶点提供了线索，但仍有待实验验证。

综上，本研究通过应用生物信息学方法对GEO数据库中AD小鼠海马组织差异表达的microRNA数据集进行挖掘，成功筛选了12个差异表达microRNA，对其中研究较少的miRNA-687进行靶基因预测后，对这些靶基因进行GO和KEGG，初步明确了其功能和相关的信号通路。此外，通过构建蛋白质互作网络图，从中选出了8个受miRNA-687调节的关键基因，为进一步研究miRNA-687及其他差异表达的microRNA参与调节AD发生的机制研究提供了新靶点。