苯肽胺酸原药和可溶液剂高效液相色谱分析方法

孟 灿，马杜康，原万玲，赵鹏跃，黄啟良

(中国农业科学院植物保护研究所，北京 100193)

苯肽胺酸(phthalamic acid)，化学名称N-苯基邻苯二甲酸单酰胺，CAS号4727-29-1，是一种白色针状晶体，微溶水、氯仿、四氯甲烷等，溶于乙醇、丙酮等有机溶剂[1]。原药外观为淡黄色或白色粉状固体。研究表明，苯肽胺酸能够增强雌花柱头的活性，促进作物开花和结果，尤其是在果树上使用具有较好的效果。在温室或大田状态下，苯肽胺酸可以诱导作物产生抗逆性，增强对逆境的适应性[2]。苯肽胺酸1982年创制于匈牙利Neviki化工工业研究所，2018年在我国以植物生长调节剂获得正式登记。开展苯肽胺酸农药产品中有效成分定性定量分析方法对于产品质控和行业监管具有重要的意义。

有文献报道了苯肽胺酸含量测定的紫外-可见分光光度法，该方法线性相关性好，重复性和准确性高[3]。吴厚斌等以邻苯二甲酸二环己酯为内标物，建立了苯肽胺酸原药的气相色谱分析方法，该方法具有较好的线性、精密度和准确度[4]。刘同金等采用气相色谱建立了苯肽胺酸在小麦及土壤中的残留分析方法[5]。秦旭等采用高效液相色谱法测定了棉花中苯肽胺酸的残留[6]。韦思华等建立了生物样品大鼠血样和组织样本中苯肽胺酸含量测定的高效液相色谱分析方法[7]。目前关于苯肽胺酸原药和制剂产品的高效液相色谱分析方法尚未见报道。本文建立了在同一液相色谱条件下测定苯肽胺酸原药和可溶液剂的方法，为苯肽胺酸农药产品质量检测提供依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 Agilent 1260-DAD 高效液相色谱仪(自动进样器)；色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18不锈钢柱(250mm×4.6mm, 5μm)；KQ3200B超声波清洗器；有机过滤器(微膜孔径0.45μm)。

甲醇(色谱纯)；二次蒸馏水；磷酸(分析纯)；苯肽胺酸标准品(质量分数99.90%)；98%苯肽胺酸原药；20%苯肽胺酸可溶液剂。

1.2 液相色谱操作条件 流动相：甲醇+0.1%磷酸水(体积比50:50)；柱温：30℃；流速：1.0mL/min；检测波长：254nm；进样体积：5μL；保留时间：苯肽胺酸约6.0min。

上述液相色谱操作条件是典型的操作参数，可以根据不同仪器特点和温度条件，对给定的操作参数进行适当的调整，以获得最佳效果。典型的苯肽胺酸标准品、98%苯肽胺酸原药和20%苯肽胺酸可溶液剂样品高效液相色谱图(图1～3)。

1.3 测定步骤

1.3.1 标准溶液的配制 称取0.025g(精确至0.000 01g)苯肽胺酸标准品于25mL容量瓶中，加入10mL甲醇，超声波振荡5min，冷却至室温，用甲醇稀释至刻度，摇匀。

1.3.2 试样溶液的配制 分别称取98%苯肽胺酸原药试样0.025g、20%苯肽胺酸可溶液剂试样0.1g(精确至0.000 01g)于100mL容量瓶中，加入20mL甲醇，超声波振荡5min，冷却至室温，用甲醇稀释至刻度，摇匀，过滤待测。

1.3.3 测定 在上述操作条件下，待仪器稳定后，连续注入数针标样溶液，直至相邻2针苯肽胺酸峰面积相对变化<1.2%后，按照标样溶液、试样溶液、试样溶液、标样溶液的顺序进行测定。

1.3.4 计算 将测得的2针试样溶液以及试样前后2针标样溶液中苯肽胺酸峰面积分别进行平均。试样中苯肽胺酸质量分数按公式(1)计算：

(1)

式中：

A2——试样溶液中苯肽胺酸峰面积的平均值；

m1——苯肽胺酸标样的质量， g；

A1——标样溶液中苯肽胺酸峰面积的平均值；

m2——试样的质量，g。

2 结果与讨论

2.1 流动相的选择 由于98%苯肽胺酸原药中有一定的杂质干扰，为使有效成分得到良好的分离效果，并且峰形尖锐，保留时间适中，根据苯肽胺酸物化性质和溶剂的紫外吸收波长，选择甲醇作为溶剂溶解样品，并以甲醇和0.1%磷酸水作为流动相，并按不同的比例在色谱柱上进行条件优化。随着甲醇比例的增加，保留时间减小，当甲醇与0.1%磷酸水体积比为60:40时，杂质峰干扰苯肽胺酸，峰纯度达不到试验要求，最终选择甲醇+ 0.1%磷酸水(体积比50:50)作为流动相，流速1.0mL/min。该条件下，苯肽胺酸色谱峰峰形较好，与杂质能完全分离，具有良好的精密度和准确度，并且分析时间较短，提高了工作效率。

2.2 检测波长的选择 利用紫外-可见检测器对苯肽胺酸溶液在210～400nm范围内进行扫描。苯肽胺酸的紫外光谱图(图4)，从图中可以看到苯肽胺酸的最大吸收波长约235nm。然而，在该波长处检测苯肽胺酸有一定的干扰，峰纯度不能达到要求，而在波长254nm处干扰较少，峰纯度达到990以上，能够满足分析的要求，故将检测波长确定为254nm。

2.3 分析方法的特异性 本试验采用HPLC-DAD峰纯度进行苯肽胺酸高效液相色谱分析方法特异性鉴别。结果表明，苯肽胺酸标样、98%苯肽胺酸原药和20%苯肽胺酸可溶液剂中的苯肽胺酸HPLC-DAD峰纯度均>990，有效成分处无其它物质干扰，符合定量分析要求。

2.4 分析方法的线性关系 按1.3.1标准品的配制方法配制标样溶液，用甲醇以1:1的比例梯度稀释4次，获得5个浓度的有效成分线性相关溶液。在上述操作条件下，待仪器稳定后，分别进同样体积的标样溶液，进行测定，取2次测定的平均结果。以苯肽胺酸质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线。从图5可以看出，苯肽胺酸质量浓度在62.69～1 003.00mg/L之间(进样体积5μL)，与相应的苯肽胺酸峰面积呈现良好的线性关系，回归方程为y=10.892x-35.057，相关系数(R2)为1.000 0，可以满足定量分析要求。

2.5 分析方法的精密度 从同一样品中称取5个试样，在上述色谱条件下进行分析，测得98%苯肽胺酸原药和20%苯肽胺酸可溶液剂的标准偏差分别为0.35%和0.11%(表1)。

表1 分析方法的精密度试验结果

98%苯肽胺酸原药中苯肽胺酸质量分数测定结果的相对标准偏差为0.35，小于修改的Horwitz公式2(1-0.51ogC)×0.67=1.34(其中C为样品中有效成分含量，以小数计)，表明有效成分分析方法精密度的测定结果符合要求。

20%苯肽胺酸可溶液剂中苯肽胺酸质量分数测定结果的相对标准偏差为0.50，小于修改的Horwitz公式2(1-0.51ogC)×0.67=1.69，表明有效成分分析方法精密度的测定结果符合要求。

2.6 可溶液剂分析方法的准确度 分别称取5个已知含量的可溶液剂试样于100mL容量瓶中，加入1.3.1中配制的苯肽胺酸标样溶液4mL，用甲醇超声溶解，冷却至室温，用甲醇定容至刻度，摇匀。苯肽胺酸的回收率按式(2)计算

(2)

式中：

R——回收率，%；

a——测定量，mg；

b——所称原药样品中待测组分量，mg；

c——理论加入量，mg。

经测定，20%苯肽胺酸可溶液剂的平均回收率为100.38%，试验结果(表2)，表明有效成分分析方法准确度的测定结果符合要求。

表2 苯肽胺酸可溶液剂分析方法的准确度试验结果

3 结论

结果表明，本方法可用于98%苯肽胺酸原药和20%苯肽胺酸可溶液剂定量分析，具有良好的分离效果，线性关系良好，具有较高的准确度和精密度，并且操作简便、快速，是进行苯肽胺酸农药产品质量检测较理想的分析方法。