花生种子霉变机理的初步研究

杨书香　刘锦轩　江阳

摘要：根据武汉市四季温度和湿度特征设置4个不同温度（8、18、28、35 ℃）和空气相对湿度（55%、75%、85%、90%），研究花生的霉变情况，计算霉变率。采用稀释涂布平板法，对发霉的花生进行微生物分离接种，纯化培养后得到2株菌株。结果表明，容易使花生种子霉变的条件为温度28℃湿度90%，此条件下的霉变率达80.0%。通过形态观测和显微镜检测初步鉴定主要为黄曲霉菌（Aspergillus flavus）和黑曲霉菌（Aspergillus niger） 〇

关键词：花生;种子霉变;黄曲霉菌（Aspergillus flavus）;黑曲霉菌（Aspergillus niger）

中圖分类号：S565.2 文献标识码：A

文章编号：0439-8114 （2020） 16-0072-04

DOI： 10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2020.16.014

霉变是微生物分解和吸收食物或植物上的有机营养物质后产生自身代谢产物的一种连续的生物化学过程，霉变发生过程中具有一定的阶段性。在这个过程中，微生物吸收分解有机物或导致食物本身物质含量发生变化，尤其是一些敏感物质，如一些活性酶的变化就非常明显，因此可以通过检测食物的相关酶活性来判断食品霉变程度，评估食品质量，制定解决方案，防止微生物的进一步污染，保证食品储存的安全性和寿命[1]。

在人类生活的环境中存在许多霉菌，置于储存室的农副产品也极易被霉菌感染，感染后的农副产品安全性及食用性基本丧失，给生产农户带来经济损失，同时如若误用或误食也会造成食物中毒等严峻的食品安全事件。当处于适当条件时，霉菌会不断消耗花生或其制品中的蛋白质等营养物质，代谢后会产生相应的毒素，且这些毒素都极不易被清除，人体或动物食用后会出现食物中毒甚至死亡，对健康造成很大的负面影响。花生产自于土壤中，在收获时，土壤中的霉菌和真菌都随着花生出土，如黄曲霉等。在储藏期间，如若储存环境的温湿度把控不严，花生就极易发生霉变[2]。

由于花生富含蛋白质等营养物质，易被霉菌感染，最主要的霉菌是黄曲霉菌，其代谢时很容易产生黄曲霉毒素。曲霉菌属真菌中的寄生曲霉菌和黄曲霉菌感染食物和植物后，消耗营养物质，产生代谢物质，黄曲霉毒素就是其中的一种次生代谢产物，其生长性能强，沙土、土壤、种子、果实都可以作为其生长基质，尤其是在玉米种子和花生等油料作物种子中较为常见，人和动物食用后会引起癌症、畸形、突变等状况。黄曲霉毒素有B1、B2、G1等十余种类型，毒性最强的属黄曲霉素B1，如果食品与动物饲料中的黄曲霉素含量超过国家标准，被人体或者动物食用后会引起食物中毒，对人类以及动物都是一种严重的安全隐患[3]。

花生的储存最重要的是要注意干燥、通风。张永辉[4]在研究中提出了花生种子储存要点包括入库储存前充分晾晒（含水量降到8%左右）、室内通风、干燥防潮、消毒并保证种子干净度、不能使用塑料密封袋储存等。

花生耐旱喜温，对气候变化反应十分敏感，温湿度、降雨量、温度差以及日照强度的改变都会影响花生品质[5]。武汉市常年降雨量较大，且具有温带四季分明的典型特征，属亚热带季风性湿润气候。年均气温为16℃，一年中1月平均气温最低，为0.4℃，7月和8月平均气温最高，达28.7℃，夏季正午温度可达38℃。城区年平均相对湿度为75%～?85%，最高湿度可达95%，最低空气相对湿度在55%左右[6]。为了探讨花生的霉变机理，依据武汉市气温和空气湿度特性，研究了不同温度和空气相对湿度条件下的花生霉变情况，以期为花生种子的生产、储存、运输过程提供理论依据。

1材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验样品 淘宝网上购买白沙果品系花生，选取饱满、无破损、无发霉、无发芽状况的良好种子去壳后作为试验样品。

1.1.2 试验仪器 电子万用炉（北京市永光明医疗仪器厂）JY2002电子天平（上海衡平仪器仪表厂），HPX-160B5H-III恒温恒湿培养箱、MJ-300BS-II 霉菌培养箱（上海新苗医疗器械制造有限公司），LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂），YXQ-SG46-280S手提式压力蒸汽灭菌器（上海博讯实业有限公司医疗设备厂），250B-J生化培养箱（金坛市鸿科仪器厂），YS100 Nikon光学显微镜。

1.1.3 试验试剂 牛肉膏、蛋白胨（北京双旋微生物培养基制品厂），氯化钠、95%乙醇、蔗糖（天津市凯通化学试剂有限公司），琼脂（武汉市华顺生物技术有限公司），可溶性淀粉（天津市风船化学试剂科技有限公司），硝酸钾、硫酸镁、硫酸亚铁、硝酸钠、氯化钾（天津市化学试剂三厂），磷酸氢二钾（上海山浦化工有限公司），草酸钠结晶紫、碘液、番红染液、乳酸石碳酸棉蓝染液等均为市售。

1.2 方法

1.2.1 培养基配制牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏0.6g，蛋白胨2g，氯化钠1g，琼脂0.1g，加无菌水定容至200 mL，调节pH 7.0～7.2， 121℃高压灭菌20 min 。

高氏1号培养基：可溶性淀粉4g，硝酸钾0.2g，氯化钠0.1g，磷酸氢二钾0.1g，硫酸镁0.1g，硫酸亚铁0.002g，琼脂4g，加无菌水定容至200mL，调节pH 7.2～7.4，121℃高压灭菌 20 min。

查氏培养基：硝酸钠0.4g，磷酸氢二钾0.2g，氯化钾0.1g，硫酸镁0.1g，硫酸亚铁0.002g，蔗糖6g，琼脂3g，加无菌水定容至200mL，121℃高压灭菌20 min。

PDA培养基（马铃薯葡萄糖琼脂培养基）：马铃薯40g，蔗糖4g，琼脂3g，加无菌水定容至200mL，121℃高压灭菌30min。马铃薯去皮切成块，煮沸30 min，用纱布过滤，加糖及琼脂，融化后补足无菌水至200 mL。

1.2.2 花生种子存放条件 根据可控条件设置温度和湿度2个因素，其中，温度为8、18、28、35℃共4个水平，湿度为55%、70%、85%、95%共4个水平，共16个处理，每处理重复3次，1个培养皿视为1次重复，每个培养皿放入40粒去壳的花生种子，把处理好的培养皿置于设定好的恒温恒湿培养箱中[7]，进行3d连续霉变培养，观察霉变情况，并拍照记录。

1.2.3 霉变花生中菌种的分离培养 取一个250 mL的锥形瓶，加入90 mL无菌水，放入已经发生霉变的花生，置于摇床摇动30 min，使其更好地混匀，制成菌悬液备用。采用涂布平板法对样品菌悬液中的微生物进行分离，将制备好的霉变花生原液设置为不同的浓度梯度，分别稀释10、100、1000倍，用已灭菌的移液枪吸取1mL各浓度梯度的稀释液加入到装有4种培养基的无菌培养皿中，使用涂布棒将菌悬液推展开，使菌悬液均匀分布，每个浓度梯度设置3次重复。将培养基置于培养箱中培养，PDA培养基、查氏培养基和高氏1号培养基的温度均恒定在28℃，牛肉膏蛋白胨培养基温度恒定在37℃。每隔24 h进行观察。

1.2.4 菌种的纯化培养 待菌落在平板培养皿上生长进入旺盛期时，挑取少量孢子进行平板划线，28℃培养后得到纯化的霉菌菌落。

1.2.5 菌种的初步鉴定

1）培养特征的观察。通过观察霉菌菌落生长繁殖速率、菌落颜色、形态，菌丝的紧密度、性质，孢子的颜色、形态，培养基颜色变化、气味等判别菌种[8]。

2）镜检。从乙醇中取出载玻片，置于火焰上灼烧后，待其冷却，在载玻片正中央滴1滴乳酸石碳酸棉蓝染液，用镊子从霉菌菌落边缘取少量带有孢子的霉菌菌丝，先放入50%乙醇中浸一下洗去脱落的孢子，置于乳酸石碳酸棉蓝染液中，用解剖针去除粘在菌丝根部的培养基，并将菌丝分开盖上盖玻片，在低倍镜中找到物像后切换至高倍镜下观察。

2结果与分析

2.1 不同条件下花生霉变情况

在温度8℃、湿度55%的处理条件下，培养3 d后霉变粒数为0粒（图1a）;在温度18℃、湿度70%的处理条件下，培养3d后霉变粒数为3粒，且霉变现象不明显（图1b）;在温度35℃、湿度70%的处理条件下，培养3d后霉变粒数为21粒，且霉变现象较明显（图1c）;在温度28 ℃、湿度70%的处理条件下，培养3d后霉变粒数为72粒（图1d）;在温度28℃、湿度95%的处理条件下，培养3d后霉变粒数为96粒，且霉变现象非常明显（图1e）。

根据公式：霉变率=霉变果粒数/检测的总粒数×100%[8]计算霉变率。由表1可知，当温度低于18℃，空气湿度在70%以下时，花生未出现霉变状况;当温度高于18℃，空气湿度在70%及以上时，花生有霉变现象;当温度为28℃，湿度95%时，霉变率最局，为 80.0%。

在相同温度条件下，湿度不同时霉变率变化情况见图2。由图2可以看出，温度不变时，在设置的湿度范围内，除8℃温度条件下都为0以外，湿度越高，霉变率越高。

由图3可以看出，空气湿度不变时，除55%湿度条件下都为0以外，霉变率在8～28℃都呈不断上升状态，在28～35℃，霉变率开始下降，在28℃时霉变率达到峰值。

2.2 四种培养基上菌落的分布

由表2可以看出，查氏培养基9个培养基全部有菌落生长，PDA培养基有5个培养基有菌落生长，牛肉膏蛋白胨培养基和高氏1号培养基没有菌落生长，判断霉变花生原液中的微生物类型可能为霉菌。

2.3分离菌株的形态特征

将查氏培养基上生长状况旺盛的菌落采用划线平板分离法进行接种，放入培养箱中进行纯化培养，每隔24h观察1次，待菌落长势良好后进行显微镜检测。结果得到1株A菌株，菌落形态特征和显微形态如图4所示。由图4可以看出，A菌落在培养基上生长繁殖速度快，颜色为黄色且带有淡绿色，表面呈稠密的粉末颗粒状。分生孢子为黄色，顶囊形态巨大呈椭圆形，从形态上初步判断是黄曲霉菌（Aspergilla flavus）。培养基带有霉味和腐臭味。

将PDA培养基上生长的菌落接种、纯化培养，每隔24h观察1次，待菌落长势良好时进行显微镜检测，结果得到1株B菌株，菌落形态特征和显微形态如图5所示。由图5可以看出，B菌落在培养基上生长繁殖速度较快，培养前期为白色絮状，蔓延性强，培养后期长出黑色孢子，呈粉末絮状。分生孢子为黑色，顶囊形态巨大呈球形，从形态上初步判断为黑曲霉菌（Aspergills niger）。培养基带有霉味和腐臭味。

3小结

本研究分析了花生在日常储存条件（不同的温度和空气相对湿度）下的霉变情况，并对霉变后的花生进行传统的微生物检测。结果显示，当温度高于18℃，空气相对湿度高于70%时出现霉变现象，且在温度28℃和湿度95%时霉变程度最明显，霉变率达80.0%。根据霉变率可以判断，湿度相同时，霉变率随着温度的上升呈先上升后下降的趋势，在28℃时，霉变率达到了峰值;温度相同时，霉变率随着湿度的上升逐渐增加。微生物检测采用传统微生物培养方法，分离菌种后进行纯化，初步判断为黄曲霉菌和黑曲霉菌。黄曲霉菌的次级代谢产物黄曲霉素是一种具毒性的致癌物质，能引发人体与动物中毒，对人体的健康和儿童的发育带来严重影响[9]。由此可见，花生的正确储存至关重要，在日常储存花生时应避免放在温度高、潮湿的地方，尤其在春夏梅雨季节时要注意对储存花生的装置进行除湿、控温处理，否则花生会发生霉变，食用后易对人体造成危害。

参考文献：

[1]张恒，郝建文，许兆棠，等.多酚氧化酶及超氧化物歧化酶与花生霉变的关系[J].食品科技，2012，31（2）：309-312.

[2]蒋雪松，刘鹏，沈飞，等.用于花生仁霉变分析的傅立叶变换红外光谱研究[J].食品科学，2016（ 11）： 1-9.

[3]隋明.益生菌混合培养物对黄曲霉菌生长以及产毒效果的影响[J]. 中国词料，2018（ 11）：45-48.

[4]张永辉.花生种子的挑选与储存[J].现代园艺，2017（6） ：38.

[5]赵瑞，许瀚卿，樊冬丽，等.气候变化对中国花生生产的影响研究进展[J].中国农学通报，2017，33（21）： 114-117.

[6]索南看卓，任国玉，贾文茜，等.武汉城市相对湿度气候学特征与长期变化趋势[J].气候与环境研究，2018，23（6）：715-724.

[7]陈小娜，邱黛玉，李燕君，等.温度和水分对甘草种子萌发的影响[J].中国农学通报，2015，31 （4）： 158-162.

[8]陈妍，卢建雄，范怀德，等.霉变干枣中菌种的分离纯化及初步鉴定[J].西北民族大学学报（自然科学版），2012，33（2）：75-80.

[9]邱西克，康彦平，郭建斌，等.花生荚壳抗黄曲霉菌侵染的鉴定方法研究及抗性種质发掘[J].中国油料作物学报，2019，41（1）：109-114.

收稿日期：2019-09-02

作者简介：杨书香（1978-），女，湖北荆州人，副教授，硕士，主要从事植物学研究，（电话）13237176800（电子信箱）54242788@qq.com;通信作者，江阳（1983-），男，讲师，硕士，主要从事化学方面的教学工作。