基于香气活性值的福建尤溪烟叶提取物香气特征成分分析

茅中一，洪祖灿，刘加增，周培琛，伊勇涛，操晓亮，张晓兵，谢金栋*

1.福建中烟工业有限责任公司技术中心，福建省厦门市集美区滨水路298号 361021 2.厦门大学化学化工学院化学系，福建省厦门市思明南路422号 361005 3.中国烟草总公司郑州烟草研究院，郑州高新技术产业开发区枫杨街2号 450001

福建烟区生态条件适合产出优质烟叶，是典型的清香型烟叶产区［1］。在全国烤烟烟叶香型风格区划中，福建烟叶风格特征是以干草香、清甜香、蜜甜香为主体，辅以青香、醇甜香、木香、烘焙香、焦香、花香和辛香等［2］，其香气风格是不同香韵特征的综合效应，而每种香韵特征的形成均具有复杂的物质基础。为发挥福建烟叶原料特点，凸显烟叶香韵风格特征，需要阐明其内在致香成分对香韵特征的贡献。

关于福建烟叶化学成分的定性分析［3-4］和烤烟烟叶理化指标与烟叶风格特征的相关分析［5-6］已有较多报道，但香气成分分析结果无法较好地与卷烟感官品质建立关联。在食品风味分析领域大量研究报道中使用香气或滋味活性值（Odor/Taste activity value，OAV/TAV）技术将香气成分分析结果与感官评价建立关联，从而筛选复杂体系关键香气活性成分、表征香气风格特征等［7-10］。近年来国内外也先后将OAV/TAV概念引入烟草科学研究领域，例如利用TAV技术分析了烟叶或烟气中关键酸味和甜味物质［11-13］，利用OAV技术研究了卷烟主流烟气总粒相物中的烟熏香、酸香、清（青）特征成分等［14-17］。而基于OAV分析烟叶提取物致香成分对凸显烟叶风格特征的研究还鲜有报道，仅近期有文献报道将OAV技术用于分析不同地区烤烟香气差异［18］。因此，以福建尤溪烟叶提取物为研究对象，确定了35种主要致香成分并按香韵特征分为7种香韵特征赋予组群，采用内标标准曲线法测定了其在烟叶提取物中的浓度，借鉴食品领域香气物质在水中的嗅觉阈值，计算了相应的OAV，比较了各香韵特征成分对各香韵特征组群的贡献度，并利用卷烟加香评吸实验对结果进行验证，旨在为加深对福建尤溪烟叶香韵风格及其物质基础的认识，构建烟叶提取物的致香成分与其香韵风格特征的有效联系提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

福建尤溪YLC01-2016烟叶由福建中烟工业有限责任公司技术中心提供。

95%乙醇、无水乙醇、二氯甲烷（色谱纯，国药集团化学试剂有限公司）；内标：氘代萘、氘代蒽（≥98%，北京百灵威科技有限公司）；标准品：己醛、糠醛、顺-3-己烯醛、6-甲基-5-庚烯-2-酮、壬醛、麦芽酚（≥95%，北京伊诺凯科技有限公司），2-甲基-3-己酮、2（5H）-呋喃酮、6-甲基-2-庚酮、反，反-2，4-庚二烯醛、甲基环戊烯醇酮、氧化异佛尔酮、反，顺-2，6-壬二烯醛（≥95%，日本东京化成工业株式会社），当归内酯、6-甲基-3，5-庚二烯-2-酮、4-乙烯基愈创木酚、香草乙酮［≥97%，阿法埃莎（天津）化学有限公司］，γ-丁内酯、5-甲基糠醛、苯甲醇、苯乙醛、2-乙酰基吡咯、4-甲基苯乙酮、β-环柠檬醛、苯乙酸乙酯、β-环高柠檬醛、异丁香酚、香叶基丙酮、二氢猕猴桃内酯（≥95%，北京百灵威科技有限公司），愈创木酚、香兰素［≥99%，阿拉丁试剂（上海）有限公司］，苯乙醇、β-大马酮、β-二氢大马酮（≥95%，美国Sigma-Aldrich公司），β-紫罗兰酮（≥95%，美国Fluka公司）。

LECO Pegasus BT4D全二维气相色谱-飞行时间质谱联用仪（美国Leco公司）；GFL1041恒温水浴锅（德国GFL公司）；Hei-VAP Precision ML旋转蒸发仪（德国Heidolph公司）；AT261变量程电子天平（感量0.000 01 g，瑞士Mettler-Toledo公司）。

1.2 方法

1.2.1 烟叶浸膏制备

取100 g烟叶原料，装入2 L圆底烧瓶中，加入1 000 g 95%乙醇，水浴80℃提取1 h；滤出第1次提取液后再加入1 000 g 95%乙醇，继续水浴80℃提取1 h。合并两次提取所得提取液，体系压力5～14kPa、水浴温度50℃下减压浓缩，控制浓缩液密度在1.37～1.38 g/cm3之间。

1.2.2 分析样品制备及定性分析条件

取8 g上述所制备的烟叶提取物，加入10 mL含内标物氘代蒽、氘代萘（浓度均为4 μg/mL）的二氯甲烷溶液，充分振荡20 min，静置后取上层清液并常温减压浓缩（体系压力20 kPa）至1.5 mL。进行全二维气相色谱-飞行时间质谱联用（GC×GC-TOF MS）分析。检测条件：

色谱柱一：Rtx-5SIL MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；色谱柱二：Rxi-17SIL MS（1.5 m×0.25 mm×0.25 μm）；升温程序；载气：He，恒流，1.4 mL/min；进样口温度：250℃；调制周期：4 s；进样量：1 μL；进样模式：分流进样；分流比：10∶1。离子化方式：EI；离子源温度：250℃；传输线温度：260℃；EI电离能量：70 eV；溶剂延迟时间：3 min；扫描模式：全扫描；质量扫描范围：45～450 amu。

采用直接进样方式进行检测，利用NIST标准谱图库对各色谱峰进行自动检索。从检索结果中挑选正向、反向检索匹配度均大于或等于80%的致香成分。

1.2.3 烟叶提取物各香韵特征成分的定量分析

使用内标法通过标准曲线对烟叶中的各香韵特征成分进行定量分析，分析条件与方法同1.2.2节，以各目标物的浓度与内标物浓度之比为横坐标，分析物与内标物的峰面积之比为纵坐标建立标准曲线。

1.2.4 致香成分嗅觉阈值的确定和OAV的计算

在化学成分复杂且相互影响的烟叶提取物中，尚未找到合适的体系或介质测定致香成分的嗅觉阈值，本研究中借鉴食品领域中香气物质在水中的嗅觉阈值来代表其实际的嗅觉阈值［16-17］。致香成分在水中的嗅觉阈值（Olfactory threshold，OT）数据主要来源于文献［19］，优先使用最新年份的阈值数据［17］；未在文献中查找到嗅觉阈值的致香成分，依据 GB/T 22366—2008［20］的方法测定其在水中的嗅觉阈值。按照公式（1）计算OAV：

式中：C为致香成分在香气体系中的质量浓度，μg/mL；OT为致香成分在水中的嗅觉阈值，μg/mL。

1.2.5 烟叶提取物及其香韵特征成分复配物的质量风格特色感官评价

用香精注射机将烟叶提取物和复配物按0.01%的比例均匀添加至参比卷烟中，将得到的样品烟支置于（22±1）℃和相对湿度（60±2）%的环境中平衡48 h。由福建中烟工业有限责任公司技术中心10名具有省级及以上卷烟感官评价资质的评委参照YC/T 530—2015［21］的方法对参比卷烟和样品卷烟进行对比评吸。

2 结果与分析

2.1 烟叶提取物致香成分定性分析结果

烟叶提取物的GC×GC-TOF MS定性分析共鉴定出73种挥发性致香成分（表1）。

表1 烟叶提取物致香成分的定性分析结果Tab.1 Results of qualitative analysis of aroma components in tobacco leaf extracts

表1（续）

2.2 烟叶提取物各香韵特征成分的确定

对定性分析出的73种致香成分进行筛选，主要依据是化合物的商品化性（例如反-2-癸烯醛、2，4-癸二烯醛、茄酮、巨豆三烯酮等未购买到合适标准品，不排除其对香韵特征有重要贡献）、安全性要求［22-23］等因素，最终筛选出35种香韵特征成分（表2），其香气特征描述和香韵归类方式主要参考相关文献［17，24-25］进行，将35种致香成分按清香、青滋香、花香、果香、焦甜香、豆香和辛香7种香韵进行归类，其特征成分分别为11、2、6、3、5、4和4种。从表2可知，许多致香成分兼具其他香韵，例如6-甲基-5-庚烯-2-酮兼有清香和果香，以清香为主；麦芽酚兼有焦甜香和果香，以焦甜香为主。

表2 各香韵特征成分的确定及其香气特征描述Tab.2 Determination of characteristic aroma components and their aroma description

2.3 烟叶提取物各香韵特征成分定量分析

采用内标法对35种致香成分定量测定的线性范围、回归方程和相关系数如表3所示，在线性范围内工作曲线线性相关系数均大于0.998。并采用此方法分别检测了上述35种香韵特征成分在烟叶提取物中的量。

从表3可知，11种清香特征成分的总量为56.71 μg/mL，其中氧化异佛尔酮未检出，香叶基丙酮、二氢猕猴桃内酯和6-甲基-5-庚烯-2-酮的量较高，其余成分的量均较低；2种青滋香特征成分的总量为0.88 μg/mL，顺-3-己烯醛的量大于反，顺-2，6-壬二烯醛；3种果香特征成分的总量为3.83 μg/mL，己醛的量最高；6种花香特征成分的总量为23.85 μg/mL，其中苯甲醇和2-乙酰基吡咯的量较高；5种焦甜香特征成分的总量为17.84 μg/mL，2（5H）-呋喃酮和糠醛的量较高；4种辛香特征成分的总量为10.76 μg/mL，4-乙烯基愈创木酚的量最高；5种豆香特征成分的总量为14.48 μg/mL，其中γ-丁内酯和4-甲基苯乙酮的量较高。

实际上，香气化合物浓度和香气强度并非简单的正比关系，还需结合嗅觉阈值得到香气活性值来综合考察其对烟叶风格特征的整体贡献［14-17］。

2.4 烟叶提取物香韵特征成分的贡献度分析

利用OAV值可从浓度和阈值两个维度上揭示香气成分对香气体系的贡献度［7］。在食品风味分析中，通常OAV＞1的香气成分被认为对整体香气具有一定的贡献度，其值越大，贡献度越大。烟叶提取物各香韵特征成分的OAV结果如表4所示。可知，10种清香特征成分中，除反，反-2，4-庚二烯醛外，其余9种成分的OAV均大于1，说明这9种成分对清香香韵均有贡献。β-大马酮和β-二氢大马酮的量之和为0.77 μg/mL，仅占清香特征成分总量的1.37%，但由于其嗅觉阈值最小，所以两者OAV之和几乎等于所有清香特征成分OAV之和；而香叶基丙酮、二氢猕猴桃内酯和6-甲基-5-庚烯-2-酮的量之和占清香特征成分总量的94.06%，但其嗅觉阈值相对较大，因而OAV较前两者低。综合分析，β-大马酮和β-二氢大马酮对清香香韵的作用更重要。据文献［16］报道，在研究玉溪C3F烟叶清香风格特征时发现β-大马酮和β-二氢大马酮在彰显烟气清香香韵时起主要作用。这表明两者结果能相互印证。2种青滋香特征成分浓度均很低，但嗅觉阈值均较小，因此OAV较高。3种果香特征成分对果香香韵均有贡献，其中己醛的贡献最大，其次是6-甲基-2-庚酮。6种花香特征成分中，尽管苯甲醇和2-乙酰基吡咯占所有花香特征成分总量的69.20%，但其嗅觉阈值均较高，两者OAV之和仅为0.56；苯乙醛和β-紫罗兰酮的OAV远大于苯乙醇和苯乙酸乙酯，在彰显花香香韵时的作用更重要。同理，甲基环戊烯醇酮和麦芽酚（焦甜香）、愈创木酚和4-乙烯基愈创木酚（辛香）、4-甲基苯乙酮（豆香）在彰显各自香韵时均起到更重要的作用。

表3 烟叶提取物中35种香韵特征成分的工作曲线与浓度分布Tab.3 Working curves and concentration distribution of 35 aroma characteristic components in tobacco leaf extracts

从各香韵特征组群的质量分数和OAV分布图（图1）可知，清香特征组群的质量分数和OAV分布均是最多的，其次是花香特征组群，而果香、焦甜香、辛香和豆香特征组群的质量分数尽管均远比青滋香特征组群大，但OAV分布却小于后者。烟叶提取物香韵特征组群的OAV分析结果显示其香韵风格是清香为主，辅以花香、青滋香、果香、焦甜香、辛香和豆香等香韵，整体来看香韵分析结果与文献［2］报道的福建尤溪烟叶的香韵风格基本吻合。综上可知，基于香气活性值的香韵特征组群分析验证烟叶提取物香韵风格特征是可行的。

由于烟叶提取物的致香成分数量较多，本研究中仅测得了34种香韵特征成分的OAV，且存在无标准品而无法测定OAV的情况；另外，各致香成分之间的交叉影响也未考虑。

表4 各香韵特征成分的香气活性值Tab.4 Odor activity values of aroma characteristic components

2.5 烟叶提取物及其香韵特征成分复配物在卷烟中的应用评价

基于福建尤溪烟叶提取物香韵特征成分质量分数与OAV分析结果，将OAV＞1的成分按照定量结果进行复配，得到的烟叶提取物香韵特征成分复配物和烟叶提取物按相同条件进行卷烟加香评价，其主要香韵特征的感官评分值见图2。

评吸结果表明：与空白卷烟相比，施加烟叶提取物的卷烟烟气清甜香突出，蜜甜香明显，花香微显，香气丰富，烟气细腻柔和，口腔舒适度有所提升；施加烟叶提取物香韵特征成分复配物的卷烟烟气具有类似尤溪烟叶的香韵特征，清甜香突出，蜜甜香和花香微显，香气质、香气量均有所改善，无明显口腔与鼻腔刺激，但香韵丰富程度较烟叶提取物低。基于OAV结果的烟叶提取物香韵特征成分复配物能赋予卷烟清甜香和花香香韵特征，能使香气质提高，同时不产生明显的刺激性，提高了卷烟抽吸品质。

图1 各香韵特征组群的质量分数和OAV分布图Fig.1 Contents and OAV distribution of aroma characteristic groups

图2 烟叶提取物及其香韵特征成分复配物的主要香韵特征感官评价结果Fig.2 Results of sensory evaluation of main aroma characteristics of tobacco leaf extracts and combination of their aroma characteristics components

3 结论

（1）福建尤溪烟叶中，10种清香、2种青滋香、3种果香、6种花香、5种焦甜香、4种辛香和4种豆香特征成分的总量分别为 56.71、0.88、3.83、23.85、17.84、10.76和 14.48 μg/mL，其中香叶基丙酮、二氢猕猴桃内酯和6-甲基-5-庚烯-2-酮（清香），己醛（果香），苯甲醇和2-乙酰基吡咯（花香），2（5H）-呋喃酮和糠醛（焦甜香），4-乙烯基愈创木酚（辛香），γ-丁内酯和4-甲基苯乙酮（豆香）在各自香韵中的质量分数较高。

（2）在烟叶中彰显各自香韵特征中起重要作用的成分有β-大马酮和β-二氢大马酮（清香）、顺-3-己烯醛和反，顺-2，6-壬二烯醛（青滋香）、己醛（果香）、苯乙醛和β-紫罗兰酮（花香）、甲基环戊烯醇酮和麦芽酚（焦甜香）、愈创木酚和4-乙烯基愈创木酚（辛香）、4-甲基苯乙酮（豆香）。福建尤溪烟叶提取物的香韵风格是清香为主，辅以花香、青滋香、果香、焦甜香、辛香和豆香等，与文献［2］报道的福建尤溪烟叶香韵风格基本吻合。基于OAV分析结果的烟叶提取物香韵特征成分复配物能够赋予卷烟清甜香、蜜甜香和花香香韵特征，香气质提高。