2型糖尿病周围神经病变动物模型的建立及检测指标分析

王 璇，徐 斌

南京中医药大学针灸推拿学院，南京 220023

糖尿病周围神经病变(diabetic peripheral neuropathy，DPN)是糖尿病的慢性并发症之一，病变累及包括感觉神经、运动神经及自主神经的周围神经系统，其特点是以周围神经由远及近逐渐退化，导致感觉症状减退或消失。DPN早期出现较小神经病变可致痛觉异常及感觉过敏，后累及较大直径髓鞘神经则出现共济失调及本体感觉减退[1]。目前DPN的发病机制尚未定论，现有研究表明除生活方式改善及严格血糖控制外，尚无其他有效治疗方法，且血糖控制仅可减缓1型糖尿病患者神经病变的病程，对于2型DPN则无从改善[2]。由糖尿病代谢失衡引起的如血糖、血脂异常及胰岛素抵抗可触发多元醇、晚期糖基化终产物及己糖胺途径的激活，导致神经元、胶质细胞及血管细胞的病理改变，最终致使包括DNA损伤、内质网应激、线粒体功能障碍、神经退行性病变的[3]神经功能障碍及神经病变是当前的主要研究方向之一。

现有动物模型无一能准确反映人类DPN的各方面表征，故近年研究多通过复制同源发病机制(如饮食诱导)或构建一致的行为表象(如基因敲除)以建立DPN特异性模型，从而提高具体研究目标的可信度。该类模型动物与人类疾病发病机制及行为表征有一定相似之处，且多数具药物治疗预见性，故作为DPN疾病模型具有研究价值。而此类方法中动物类别、诱导方法、并发症持续时间、成模指标等因素均影响动物成模质量，进而直接影响实验结果。因此，构建一种合格有效、标准明确、创建易行的DPN动物模型是研究人类DPN疾病的关键。本研究通过阅读动物实验文献，对2型DPN模型常用动物、造模方法、成模指标、适用指征等进行了分析。

资料和方法

文献来源及检索策略检索PubMed、中国知网(CNKI)、万方(Wanfang)等数据库中2009至2019年间有关2型DPN动物实验的文献，同时纳入研究的参考文献。中文检索策略为：2型糖尿病 and 周围神经病变；英文检索策略为：type 2 diabetes and neuropathy and type 2 diabetic neuropathy。

纳入与排除标准纳入标准：(1)用动物复制DPN模型；(2)随机对照分组实验；(3)观察组造模成功后有明确评价指标。排除标准：(1)临床试验及研究；(2)研究设计不符合纳入标准；(3)重复发表文章；(4)与DPN无关的文献；(5)数据描述不详；(6)无法获得全文。

数据处理将符合纳入标准的文献分别提取动物模型、造模方法、检验标准等信息建立数据库，并作图表进行对比分析。

结 果

文献检索结果共检索出526篇文献，按预先制定的纳入及排除标准筛选文献并核对，最终筛选出中文文献25篇，英文文献50篇，共75篇文献符合要求。

模型建立途径实验多选用雄性动物，啮齿类动物在模型构建中运用较多，占所有实验动物的98.6%。实验模型建立途径包含基因敲除模型，如糖尿病脂肪大鼠(ZDF大鼠)、瘦素受体敲除小鼠(db/db小鼠)、瘦素缺乏小鼠(ob/ob小鼠)等；实验诱导模型如SD大鼠、Wistar大鼠、C57BL/6小鼠等；饮食诱导模型如DIO大鼠；转基因模型如SDT大鼠、apoE小鼠。实验诱导模型占比57.3%(图1)。

模型建立方法基因敲除模型和实验诱导模型为实验多用模型，其中实验诱导模型为模拟2型糖尿病发病过程而建立的模型，较基因敲除模型病变表型更为明显，后者如db/db小鼠虽有持续性高血糖及显著神经病变，但没有明显的热痛觉减退或过敏及表皮内神经纤维数量的变化[4]，不利于相关实验数据采集。故现实验多用诱导模型，即高能饮食喂养结合STZ注射，可较好模拟2型DPN的发病过程及症状。75篇文献中，有43篇选用实验诱导模型(图1)。

图1 2型糖尿病周围神经病变动物模型分布

高能饲料配比高能饲料中脂肪类型及含量影响糖尿病的发展，饱和脂肪(如猪油)较不饱和脂肪(如鱼油)更能引起动物的胰岛素抵抗，故而高能饲料的配比对于诱导2型糖尿病动物模型十分关键。在已公开配比的24例研究中，高脂高糖饲料多采用10%～15%猪油配比，高脂饲料多采用45%～60%的猪油配比(表1)。

表1 高能饲料配比及频次表

链脲佐菌素注射剂量链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)可选择性破坏动物胰岛β细胞，诱发糖尿病。33例实验中，小剂量STZ注射(<50 mg/kg)占比84.8%，其中，30～35 mg/kg为常用给药剂量，占比达54.6%(表2)。

表2 STZ给药方法及频次表

成模检测指标2型DPN动物模型成模检测包括2型糖尿病成模检测及周围神经病变成模检测，前者多以给药后段时间内血糖值为标准，后者以周围神经症状及体征的相关检测指标为依据。综合75篇文献可见血糖检测多以7 d后空腹血糖>11.1 mmol/L结合胰岛素抵抗为主要指标；周围神经病变成模检测多用生理生化指标、神经电生理检测、行为学检测及病理形态学检查，其中单项检测以血糖、运动感觉神经传导速度及机械痛、热痛觉检测相结合为成模检测主要指标。研究者多采用行为学检测及神经电生理检测，行为学以测定热痛觉及机械痛觉为主，以潜伏期时长作为参考指标衡量动物模型周围神经病变的发展情况(表3、4)。

表3 2型糖尿病成模血糖检测时间及频次表

表4 周围神经病变成模检测方法及频次表

模型特征及适用研究内容2型DPN动物模型旨在模拟人体DPN发病特点及症状，以便用于研究其发病机制、筛选干预措施，模型建立途径、成模检测方法及模型适用研究统计见表5。

表5 2型糖尿病周围神经病变动物模型建模方法、成模特征及研究内容统计表

讨 论

据国际糖尿病联合会统计，目前全球近25亿人患有DPN，且呈逐年增长趋势[16- 17]，2型糖尿病患者占比60%～70%[18]，其发病涉及复杂而相关联的发病机制，包括高糖参与的外周神经损伤机制、血脂紊乱的影响机制以及代谢性炎症、神经滋养血管病变等[19]，临床主要表现为由远及近的肢体麻木、痛觉减退，出现运动及感觉障碍，早期相对可逆，晚期则发展为顽固性难治性神经损伤。为研究其治疗方法，探究其发病机制，建立一种匹配度高的2型DPN动物模型则十分必要。

2型DPN动物模型需具备与临床相似的结构、功能特征，实验诱导型大鼠模型因其成模率高、死亡率低、重复性强、发病时间一致等特点在研究中广泛采用[20]。该模型多采用高能饮食结合STZ诱导方法，高能饮食可导致TG及游离脂肪酸在β细胞内堆积，进而造成神经酰胺增加，并通过不同途径激活肌醇需求激酶1等损伤内质网，诱导胰岛β细胞凋亡[21]。高能饮食中的脂肪含量及类型均影响糖尿病严重程度[22]。喂食含饱和脂肪(如猪油)的高能饮食更易导致肥胖，数据分析可见，高能饲料中10%猪油及20%蔗糖(供能约40～50 kcal)配比运用较多，研究证明该配比高能饮食喂养动物模型具较高成模率及中度高血糖特点[23]，符合2型糖尿病动物模型要求，且45～60 kcal高能饮食喂养啮齿动物模型会出现神经传导减慢、行为学改变(如痛觉减退)及表皮内神经纤维数量减少等周围神经病变表型[24]。

2型糖尿病发病特点主要为胰岛素抵抗及胰岛β细胞功能受损[25]。STZ可选择性破坏胰岛β细胞，注射剂量影响动物模型胰岛功能。高剂量STZ注射动物模型具稳定的高血糖，但无显著神经病变[26]；低剂量STZ注射动物模型血糖水平逐渐升高，胰岛β细胞呈进行性破坏，符合2型糖尿病特征。筛选文献中71.4%选用25～35 mg/kg剂量腹腔注射，小剂量STZ注射动物模型具成模率高、死亡率低、血糖中度升高、β细胞胰岛素分泌障碍等特点[27]，故为动物模型建立多用。

2型DPN动物成模指标分为2型糖尿病成模检测及周围神经病变成模检测。高血糖及胰岛素抵抗为2型糖尿病主要特征，以实验诱导型动物模型为例，各文献中确立动物糖尿病血糖值标准不一，以给药7 d后空腹血糖>11.1 mmol/L或给药后96 h随机血糖>13.8 mmol/L多用，结合指标包含体质量指数、胰岛素敏感指数、空腹胰岛素等。周围神经病变成模检测指标包括行为学检测、神经电生理检测、病理形态学检查及生理生化指标检测，通常以多种指标相结合判定。

行为学检测为检测动物模型是否出现疼痛相关行为，如抑郁倾向、痛觉迟钝或过敏、声音改变、自残等。统计发现，实验中对动物模型行为学检测局限于热痛及机械痛(占比约90%)，对厌恶、抑郁等反应的测定仅有2例，因动物模型痛觉测定会出现行为依赖，该情况下的测定结果不能代表对刺激的反应，故而行为学测试需综合考量。

神经电生理学检测主要包括运动、感觉神经传导速度测定及动作电位振幅测定，前者通过测定有髓神经纤维传导速度以评定神经元及髓鞘的功能状态[28]，后者通过计算动作电位振幅总和评估轴突损伤程度，两者综合评定神经功能障碍程度。统计发现，研究者侧重于测定运动、感觉神经传导速度(占比约93.5%)，较少测定神经动作电位振幅，后者在啮齿动物模型中意义不显，因动作电位振幅受机体状态等多因素影响，临界阈值与肌肉疲劳程度呈负相关，误差率高达40%[29]，故不宜纳入主要测量指标范畴。神经传导速度主要测定大直径有髓纤维的功能状态，无法对小直径无髓纤维损伤程度定性，故需结合其他指标。

病理形态学检查包括病理学检查和形态学分析，数据分析可见研究者最常用为坐骨神经病理形态学定性检查及表皮神经纤维密度定量检查。坐骨神经形态、髓鞘、轴索等结构均可直接反映神经损伤，是周围神经病变最直观证据。在DPN动物模型中通常可见坐骨神经髓鞘板层结构分离、排列紊乱、轴索变形等特征，干预后见坐骨神经空泡、裂隙减少、髓鞘形态改善则可说明干预措施有效。表皮神经纤维密度多用于量化神经损伤程度，皮肤神经纤维中90%以上为直径小于7 μm的小直径无髓神经纤维和髓鞘稀疏神经纤维，在周围神经病变早期还未表现出明显临床症状及电生理依据时可灵敏反映数量及形态异常，准确率及特异性达90%，弥补了常规电生理仅能检测大直径有髓神经纤维功能的局限性[30- 31]。

目前不同类别动物模型均被证实无法完全模拟2型DPN病理表征，各建模方法及研究内容均有侧重。基因敲除模型因其显著的病理形态学指征多用于研究DPN中后期病变机制研究；饮食诱导模型出现肥胖相关指征，多适用于DPN早期病变及肥胖相关研究；转基因模型多伴血脂异常表现，并且在模型早期即可出现病理指征，适用于DPN的血脂异常、性别机制及分子变化特征[32]研究；实验诱导模型模拟人DPN发病机制，且可被胰岛素给药验证，是目前研究各干预措施起效途径多用的模型。

评价一个动物模型的良莠需依据“三性”特征，即发病机理同源性、行为表象一致性、药物治疗预见性，兼备创建易行性、重现性与经济性特点[33]。2型DPN动物模型中，实验诱导模型较基因敲除等模型兼具以上优势，且模型特征显著，主要表现为运动及感觉神经传导速度降低、痛觉异常、表皮神经纤维数量降低、神经及髓鞘轴突直径缩小、轴突萎缩、髓鞘空泡变化明显[34]以及胰岛素抵抗等病理表征，部分模型可出现血脂异常等肥胖指征，适用于研究肥胖患病率与糖尿病并发症发病率的潜在机制，为当前研究热点[35]。该模型病理表征较早出现，在STZ注射约9周后(模型约17周龄时)即可出现无髓鞘神经轴突明显萎缩，而基因敲除模型如db/db小鼠在25周龄时出现相关指征。DPN在人体表现为终末感觉神经纤维病变，出现肢体远端麻木或过敏等症状，这是由于病变累及小直径纤维如Aδ及C纤维引起的[36]，此类小直径纤维为表皮内神经纤维，是动物模型与人体DPN神经损伤一致性的评判标准[37]。实验诱导模型的小直径无髓鞘神经纤维较大直径有髓鞘神经发病更早、病变更为明显[38- 39]，且实验诱导模型表皮内神经纤维密度均降低明显，趋势具一致性。

综上，本研究通过统计分析相关文献，总结当前2型DPN动物模型建立方法及检测指标，并根据多个实验研究对成模指标进行逐一分析，综合各指标评价动物模型成模标准，发现以实验诱导建立啮齿动物模型，且喂食含10%猪油及20%蔗糖的高脂高糖饲料或40～50 kcal的高能饲料并结合低剂量(25～35 mg/kg)注射STZ时，模型质量可达最优。该模型兼备复制率、成模率、可操作性及病理同源性，为研究2型DPN发病机理及干预措施起效途径的优质模型。