下调miR-4262抑制肺癌细胞A549转移潜能的机制

朱丽 龚波

肺癌具有早期临床特征不明显、恶性程度高等特点，很多肺癌患者在确诊时已经发生了转移，并且很多肺癌患者死于肺癌转移［1］。肿瘤细胞侵袭、迁移和上皮间质转化（epithelial mesenchymal transition，EMT）能力的大小与肿瘤转移水平有关，降低肿瘤细胞的转移潜能、抑制肿瘤进展和转移是目前抗肿瘤研究的重点。微小RNA（microRNA，miRNA）是一个人体内普遍表达的非编码RNA 分子，具有很多生物学作用，如细胞生长、胚胎发育、疾病发生、免疫调控等，miRNA 通过复杂的调控机制影响生命进程［2］。随着人们对miRNA的不断深入研究发现，疾病的发生与多种miRNA的表达关系密切，miRNA 可能是疾病诊断、治疗的分子靶标［3］。在肿瘤中的研究显示，miRNA 参与肿瘤细胞的生长和转移，分子靶向miRNA 有望成为肿瘤治疗重要途径［4］。目前对于miR-4262 在肺癌细胞侵袭、迁移和EMT 中的作用还未明确。本次实验探讨miR-4262 对肺癌细胞转移潜能的影响和机制，以期为寻找有效的分子标记物治疗肺癌提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

miRcute 增强型miRNA cDNA 第一链合成试剂盒、miRcute 增强型miRNA 荧光定量检测试剂盒（SYBR Green）、Quant one step qRT-PCR Kit（SYBR Green）均购自天根生化科技（北京）有限公司；vimentin 抗体、KLF3 抗体购自美国Abcam；E-cadherin 抗体和HRP 标记的二抗均购自美国Santa Cruz Biotechnology；inhibitor control、miR-4262 inhibitor 购自上海吉玛制药技术有限公司；WT（野生型）和MUT（突变型）荧光素酶报告载体由吉满生物科技（上海）有限公司构建；KLF3 siRNA 和siRNA control 由天津赛尔生物技术有限公司构建合成；肺癌细胞NCI-H446、A549、NL9980 购自美国ATCC；正常支气管上皮细胞HBE 购自上海铭博生物科技有限公司。

1.2 qRT-PCR 方法测定miR-4262 和KLF3 mRNA表达

分别用Trizol 试剂提取收集的NCI-466，A549，NL9980，同时提取肺癌细胞NCI-H446、A549、NL9980 和正常支气管上皮细胞HBE 的总RNA。miR-4262 检测用miRcute 增强型miRNA cDNA 第一链合成试剂盒反转录合成cDNA，然后以miRcute 增强型miRNA 荧光定量检测试剂盒（SYBR Green）进行PCR 反应，结果以U6 作为内参，2-△△Ct 法计算。KLF3 mRNA 检测用Quant one step qRT-PCR Kit（SYBR Green）进行RT-PCR 反应，结果以GAPDH 为内参，2-△△Ct 法计算。

1.3 细胞转染分组

肺癌细胞A549 分成3 组，分别为Control、Anti-NC、Anti-miR-4262 组，Anti-NC、Anti-miR-4262 组分别为转染inhibitor control、miR-4262 inhibitor 的肺癌细胞，Control 为空白对照细胞。细胞转染操作方法完全按照转染试剂Lipofectamine 2000 操作说明进行。细胞转染后48 h，用qRTPCR 方法测定miR-4262 和KLF3 mRNA 表达变化，步骤同1.2。

1.4 MTT 方法测定增殖

分别按照Control、Anti-NC、Anti-miR-4262 组分组方法将细胞按照每个孔内4 000 个细胞接种至96 孔板中，培养48 h 后取出培养板，加MTT，于37℃条件下孵育4 h。添加150 μL 的二甲基亚砜溶液，10 min，检测每个孔的OD 值，OD 值越高，细胞增殖能力也就越强。

1.5 Transwell 小室测定侵袭和迁移

在细胞侵袭实验之前需要基质胶包被小室，迁移实验前省去包被步骤，其余相同甲醇固定，结晶紫染色。显微镜下计数细胞穿膜数目。

1.6 Western blot测定E-cadherin、vimentin蛋白表达

常规方法提取Control、Anti-NC、Anti-miR-4262 组细胞总蛋白，SDS-PAGE 凝胶用5%的浓缩胶和10 %的分离胶；电泳电压为90 V 恒压电泳0.5 h（观察染料即将进入分离胶），然后以120 V 恒压电泳2 h。在60 V 恒压条件下转膜。将NC 膜浸泡在含有5%脱脂奶粉的封闭液中封闭；把NC膜置于一抗中，4℃过夜；NC 膜放在二抗中结合2 h。ECL 显色。Image J 分析条带的OD 值，把GAPDH 作为内参。E-cadherin、vimentin 一抗以1∶1 000 稀释，二抗以1∶2 000 稀释。

1.7 靶基因预测和鉴定

生物信息学软件（Targetscan）预测发现miR-4262 和KLF3 的3′UTR 端有互补结合位点，利用荧光素酶报告系统鉴定二者的靶向关系。将WT和MUT 荧光素酶报告载体分别与inhibitor control、miR-4262 inhibitor 共转染后肺癌细胞A549中。用荧光素酶活性测定试剂盒检测细胞荧光素酶活性变化。同时收集Control、Anti-NC、Anti-miR-4262 组细胞，用qRT-PCR 和Western blot方法分别检测细胞中KLF3mRNA 和蛋白表达变化，步骤同1.2 和1.6。

1.8 KLF3 siRNA 对下调miR-4262 逆转功能检测

分别在肺癌细胞A549 中将miR-4262 inhibitor、siRNA control 和miR-4262 inhibitor、KLF3 siRNA共转染，记为Anti-miR-4262+si-NC 和Anti-miR-4262+si-KLF3 组，细胞培养48h 以后，MTT 测定增殖、Transwell 小室测定侵袭迁移、Western blot 测定E-cadherin、vimentin、KLF3 蛋白表达。

1.9 统计学分析

采用SPSS 21.0 软件进行数据统计分析，计量资料用（±s）表示，两组数据之间的比较用t检验，多组间比较用单因素方差分析，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-4262 在肺癌细胞中高表达

肺癌细胞NCI-H446、A549、NL9980 中miR-4262 表达水平明显高于正常支气管上皮细胞HBE（P＜0.05）。见表1。

表1 肺癌细胞和正常支气管上皮细胞中miR-4262 表达水平（±s）Table 1 miR-4262 expression levels in lung cancer cells and normal bronchial epithelial cells（±s）

表1 肺癌细胞和正常支气管上皮细胞中miR-4262 表达水平（±s）Table 1 miR-4262 expression levels in lung cancer cells and normal bronchial epithelial cells（±s）

细胞HBE NCI-H446 A549 NL9980 F 值P 值miR-4262 水平1.00±0.12 1.76±0.13 2.65±0.23 2.02±0.15 157.42＜0.001

2.2 下调miR-4262 对肺癌细胞增殖、侵袭、迁移和EMT 影响

转染miR-4262 inhibitor 后的肺癌细胞中miR-4262 表达水平明显降低，细胞OD 值、侵袭数目、迁移数目以及细胞中vimentin 蛋白表达水平均下降，E-cadherin 蛋白表达水平升高（P＜0.05），图1和表2。

2.3 miR-4262 和KLF3 互为靶向关系

生物信息学软件发现miR-4262 和KLF3 的3′UTR 端有互补结合位点，并且WT-KLF3 和miR-4262 inhibitor 共转染后的细胞荧光素酶活性升高（P＜0.05），图2和表3。

表2 肺癌细胞OD 值、侵袭数目、迁移数目和E-cadherin、vimentin 蛋白水平（±s）Table 2 Lung cancer cell OD value,invasion number,migration number,and E-cadherin and vimentin protein levels（±s）

表2 肺癌细胞OD 值、侵袭数目、迁移数目和E-cadherin、vimentin 蛋白水平（±s）Table 2 Lung cancer cell OD value,invasion number,migration number,and E-cadherin and vimentin protein levels（±s）

组别Control Anti-NC 组Anti-miR-42 组62 F 值P 值miR-4262 1.00±0.09 0.97±0.12 0.45±0.05 103.29＜0.001 OD 值0.43±0.04 0.44±0.03 0.32±0.02 41.28＜0.001侵袭数目98.45±9.33 99.24±7.25 64.36±4.21 68.05＜0.001迁移数目125.30±10.35 126.83±11.20 85.34±7.29 52.30＜0.001 E-cadherin 0.22±0.02 0.21±0.03 0.35±0.05 43.34＜0.001 vimentin 0.56±0.05 0.54±0.04 0.33±0.02 97.40＜0.001

表3 细胞荧光素酶活性比较（±s）Table 3 Comparison of cell luciferase activity（±s）

表3 细胞荧光素酶活性比较（±s）Table 3 Comparison of cell luciferase activity（±s）

组别Anti-NC Anti-miR-426 t 值P 值MUT 1.00±0.11 0.98±0.08 0.67 0.44 WT 1.00±0.12 1.45±0.13 7.63＜0.001

2.4 下调miR-4262 对肺癌细胞中KLF3 表达影响

转染miR-4262 inhibitor 后的肺癌细胞中KLF3 蛋白和mRNA 水平明显升高（P＜0.05），图3和表4。

2.5 KLF3 siRNA 逆转下调miR-4262 抑制肺癌细胞增殖、侵袭、迁移、EMT 功能

与共转染siRNA control 和miR-4262 inhibitor的肺癌细胞比较，共转染KLF3 siRNA 和miR-4262 inhibitor 后的肺癌细胞OD 值、侵袭数目、迁移数目和vimentin 蛋白水平均升高，细胞中KLF3、E-cadherin 蛋白表达水平降低（P＜0.05）。图4和表5。

表4 转染miR-4262 inhibitor 后的肺癌细胞中KLF3 蛋白和mRNA 水平比较（±s）Table 4 Comparison of KLF3 protein and mRNA levels in lung cancer cells transfected with miR-4262 inhibitor（±s）

表4 转染miR-4262 inhibitor 后的肺癌细胞中KLF3 蛋白和mRNA 水平比较（±s）Table 4 Comparison of KLF3 protein and mRNA levels in lung cancer cells transfected with miR-4262 inhibitor（±s）

组别Control Anti-NC Anti-miR-4262 F 值P 值KLF3 蛋白0.28±0.03 0.29±0.05 0.67±0.07 160.89＜0.001 KLF3 mRNA 1.00±0.08 0.99±0.13 2.24±0.21 207.00＜0.001

3 讨论

miRNA 在真核生命体中存在，并且具有十分广泛的生物功能，miRNA 与细胞分化、氧化应激、细胞增殖等有关。研究显示，miRNA 虽然没有编码蛋白质的功能，但是其可以通过调控靶基因的表达发挥多种作用，广泛的参与到机体新陈代谢、组织修复、免疫功能维持等生命活动中［5］。miRNA还参与疾病如心肌梗死、肾组织损伤等进展，miRNA能够通过影响细胞的生物学行为而发挥作用［6］。肿瘤细胞的恶性增殖和转移同样也受到miRNA的调节作用，这些与肿瘤有关的miRNA 在肿瘤进展中发挥类似癌基因或抑癌基因的作用，影响细胞的增殖和侵袭过程［7］。研究报道表明，miR-4262在乳腺癌、肝癌等多种肿瘤中高表达，其可以促进肿瘤的进展和转移［8］。在结肠癌中的研究认为，miR-4262 抑制肿瘤细胞的增殖［9］。本次实验结果提示miR-4262 可能在肺癌进展和转移中发挥促进作用。

研究认为，肿瘤的转移除了与肿瘤细胞的侵袭和迁移能力有关以外，还与肿瘤细胞EMT 水平密切相关［10］。EMT 是广泛存在于机体内的正常生理过程，其在胚胎发育、组织生长过程中扮演关键角色。EMT 发生时，上皮细胞表型逐渐减弱而间质细胞表型逐渐增加。E-cadherin 是上皮细胞标志蛋白，vimentin 是间质细胞标志蛋白［11］。发生EMT 的肿瘤细胞的转移概率大大增加，也就是说，EMT 水平越高，肿瘤细胞转移潜能也就越高［12］。本次的实验显示，下调miR-4262 后的肺癌细胞中的E-cadherin 蛋白表达水平升高，vimentin 蛋白表达水平降低，提示下调miR-4262 可以降低肺癌细胞的转移潜能，这与细胞侵袭和迁移检测结果相符合，均说明下调miR-4262 具有抑制肺癌转移的作用。

miRNA 作用机制与靶向调控靶基因的表达有关，并且miRNA 的靶基因可能同时有多个，在不同的病理或生理进程中的靶基因可能不同［13］。本次实验表明，下调KLF3 可以逆转下调miR-4262对肺癌细胞增殖、迁移、侵袭和EMT 的抑制作用，提示miR-4262 可能通过KLF3 影响肺癌细胞的生长和转移。

表5 肺癌细胞OD 值、侵袭数目、迁移数目和KLF3、E-cadherin、vimentin 蛋白水平比较（±s）Table 5 Lung cancer cell OD value，invasion number，migration number and KLF3，E-cadherin，vimentin protein level comparison（±s）

表5 肺癌细胞OD 值、侵袭数目、迁移数目和KLF3、E-cadherin、vimentin 蛋白水平比较（±s）Table 5 Lung cancer cell OD value，invasion number，migration number and KLF3，E-cadherin，vimentin protein level comparison（±s）

组别Anti-miR-426 组2+si-NC 组Anti-miR-4262+si 组-KLF3 组t 值P 值OD 值0.33±0.03 0.42±0.04 5.40＜0.001侵袭数目65.67±5.75 86.43±6.87 6.95＜0.001迁移数目86.32±5.76 110.54±9.04 6.78＜0.001 E-cadherin 0.39±0.06 0.23±0.04 6.67＜0.001 vimentin 0.34±0.04 0.58±0.07 8.93＜0.001 KLF3 0.63±0.08 0.32±0.04 10.40＜0.001

总之，miR-4262 在肺癌中可能发挥促进作用，下调其表达可以通过靶向促进KLF3 的表达降低肺癌细胞转移潜能，这为研究miR-4262 在肺癌中的作用提供了参考，为靶向基因治疗肺癌提供了思路。以后实验会在多株肺癌细胞中进行验证，并且会对其在肺癌患者中的表达变化与临床病理特征的关系进行具体分析。