STAT3在远隔缺血预处理中预防造影剂肾损伤的作用*

罗文龙，张新会，崔 茜，王 超，李轶男，余学文，裴汉军

(1.内蒙古科技大学包头医学院研究生院，内蒙古 包头 014010；2.包头医学院第一附属医院心内三科)

造影剂肾病(Contrast induce nephropathy，CIN)是临床介入诊疗中的常见并发症，随着介入诊疗的广泛开展，其发病率也逐年上升，主要病理生理过程是肾缺血[1]。远隔缺血预处理(Remote ischemic preconditioning，RIPC)是一项较好的CIN预防措施，RIPC预防CIN的机制尚未明确，目前对于RIPC预防CIN机制的实验研究主要集中在机体神经体液调节机制和细胞分子信号通路机制上。国内有研究发现急性期RIPC组和延迟期RIPC组较IR组血Cr、BUN、微量白蛋白(mALB)、β2-微球蛋白(β2-MG)、髓过氧化物酶(MPO)、丙二醛(MDA)水平均降低，超氧化物歧化酶(SOD)水平升高，证实RIPC对大鼠缺血再灌注损伤有保护作用[2]。

信号转录因子3(Signal transcription factor 3，STAT3)是一种DNA结合蛋白。研究发现，信号转导抑制剂能够下调JAK-STAT3途径，与细胞因子受体结合后能够增加JAK和STAT3蛋白的水解，减弱JAK激酶活性。活化蛋白抑制剂能够特异性结合STAT3单体而阻止STAT3二聚化，继而减少其靶基因的表达。当前研究结果在STAT3对缺血再灌注损伤的作用方面存在分歧，有些研究显示STAT3可以减轻缺血再灌注对组织的损伤。例如，Yamashita等发现，激活STAT3能降低促凋亡蛋白Bax水平，升高抑制凋亡蛋白Bcl-2水平，减少脑细胞凋亡，进而减小脑梗死面积，起到脑保护作用[3]。Smith等研究表明，激活小鼠心肌STAT3基因能够减轻阿霉素引起的小鼠心肌细胞损伤，说明STAT3对心肌细胞有保护作用[4]。另一些研究显示STAT3可以加重组织缺血再灌注损伤，例如，Mascareno等在大鼠心脏缺血再灌注损伤模型中观察到，心肌缺血再灌注损伤时JAK-STAT通路被激活，缺血期和再灌注2 h，JAK2、STAT1、STAT3、STAT5a和STAT6表达水平均升高，用ACA90(JAK2阻断剂)处理后下调了JAK2水平，减弱了心肌的缺血再灌注损伤，说明上调JAK-STAT途径可诱发心肌缺血再灌注损伤，而抑制该途径有改善缺血再灌注损伤的作用[5]。既往STAT3在肾缺血再灌注损伤中的作用研究很少，本研究通过观察RIPC对急性肾缺血小鼠肾组织蛋白STAT3表达的影响，进一步探讨STAT3在RIPC预防肾缺血再灌注损伤中发挥的作用。

1 对象与方法

1.1研究动物及试剂 选取健康的C57BL/6小鼠，8～10周龄，体重20～25 g，共30只。实验动物购自北京维通利华实验动物技术有限公司[许可证号：SCXK(京)2016-0002]，置于空调饲养室中，严格按照实验室清洁级标准对实验动物进行饲养，并保持动物饲养室内温度适宜、安静，且满足12 h光照、12 h黑暗的光照周期，定期更换饲料及饮用水，保证动物自由进食水。本研究严格遵守实验动物管理条例，并获得内蒙古科技大学包头医学院实验动物伦理委员会批准。血肌酐试剂盒购自浙江伊利康生物技术有限公司,STAT3抗体购自Abcam公司。

1.2方法

1.2.1实验动物分组及建模

1.2.1.1实验动物分组 30只C57BL/6小鼠，随机分为3组，即肾缺血再灌注组(IR)、远隔缺血预处理组(RIPC)和正常对照组，每组10只。

1.2.1.2实验动物模型制备 (1)缺血再灌注组：将麻醉后的小鼠固定于动物实验手术台上，双侧背部切口暴露腹腔，钝性游离双侧肾蒂，用微动脉止血夹夹闭双侧肾蒂，夹闭30 min后撤除止血夹，恢复肾脏灌注，复位肾脏，缝合双侧背部创口。(2)远端缺血预处理组(RIPC)：结扎小鼠左侧下肢，进行3个周期交替5 min结扎和松开，其余同缺血再灌注组。(3)正常对照组：不进行双侧背部切开及肾蒂夹闭等手术操作。

1.2.2小鼠血肌酐测定 将各组小鼠血液样本3 000 rpm条件下离心5 min，根据组别将离心后的血清移至生化分析仪样本瓶中，按照血肌酐检测试剂盒说明书，使用生化分析仪进行检测。

1.2.3Western blot法检测肾组织STAT3 (1)提取小鼠肾组织中的总蛋白：取适量大小的肾组织放入干净的1.5 mL离心管中，并标号。将组织裁剪成细小的碎片，加入600 μL的组织裂解液，并加入1 %蛋白酶抑制剂。用超声仪超声20次(50强度，工作/间歇时间50 %)。于4 ℃、12 000 g下离心5 min，将上清用移液器移入新的1.5 mL离心管中，置于-80 ℃留存。(2)蛋白浓度测定：取新96孔板，在板盖标号。A、B排为标准曲线，做两个重复孔，加一个空白对照；C、D为样品编号，做两个重复孔。稀释蛋白液(4 μL蛋白液加8 μL去离子水)。配制工作液(100 μL)，将试剂盒中A、B液混合，比例为50∶1。在孔板中加入工作液和蛋白稀释液，比例为工作液：蛋白稀释液(或标曲)=20∶1。盖上板盖，37 ℃恒温震荡器摇30 min，放入酶标仪检测吸光度值，根据公式计算样品蛋白浓度。(3)SDS-PAGE凝胶的制备：取出灌胶玻璃板将其清洗干净，待干燥后使用。随后配制10 %的分离胶7.5 mL，将配置好的分离胶迅速用移液器移至凝胶玻璃槽中，使其液面到标志线位置(样品梳下方0.5～1 cm处)，立即用去离子水将胶面覆盖，有助于隔绝空气，保持室温25 ℃，放置大约40 min，直至分离胶凝固。倒掉上层去离子水，用吸水纸吸走残余液体，把凝胶板再次垂直放置，将配置好的5 %的浓缩胶液2.5 mL迅速用移液器移至凝胶玻璃槽中，要避免产生气泡，将样品梳快速插入凝胶玻璃槽中，室温条件下凝固30 min。随后轻轻拔出样本梳，用夹子把玻璃夹紧，放置于电泳槽上，凹面紧贴电泳槽。(4)样本变性及电泳：将总蛋白样本从-80 ℃冰箱拿出，依据测出的蛋白浓度结果计算上样量。将20 μg加热变性后的样品按照由浓度计算所得体积分别轻轻添加到凝胶孔中，把电泳仪接通电源，并将电压调到90 V使样品通过浓缩胶，120 V通过分离胶，当电泳至分离胶合适位置时停止电泳。(5)凝胶的转模和检测：第一步，把剪好的PVDF用100 %甲醇浸泡5 min。第二步，先将3层滤纸剪裁成与胶同样大小，再将3张滤纸裁剪成稍微小一点尺寸，后将滤纸用转移缓冲液浸泡后待用。第三步，将电泳板取下、平置(使“凹”面玻璃板位于下面)，仔细分开两层玻璃板，拿掉上面玻璃板，去除玻璃板上的多余凝胶，用电转液漂洗含样本的凝胶。第四步，取出转模夹板浸泡在转膜缓冲液中，由阴极侧开始，依次放入纤维垫、3层滤纸、样品胶、PVDF膜、三层滤纸，注意清除气泡。第五步，连接转膜电泳仪连线进行转模，转膜时间为60 min。第六步，封闭：先用脱脂奶粉和1×TBST(1∶20)配制封闭液，放入转有样品蛋白的PVDF膜，封闭2 h。第七步，一抗反应：先用稀释液稀释STAT3抗体(1∶1 000)和β-actin抗体(1∶1 000)，然后分别放入封闭后的PVDF膜，4 ℃反应过夜。第八步，洗膜：一抗反应结束后用1×TBST洗膜3次，5 min/次。第九步，二抗反应：先用稀释液稀释山羊抗兔IgG的二抗(1∶20 000)，然后分别放入一抗反应后的PVDF膜，室温下作用60 min。第十步，洗膜3次，5 min/次。第十一步，曝光。第十二步，UVP凝胶成像分析系统采图，分析软件分析灰度值。

2 结果

2.1各组小鼠血肌酐结果分析 IR组与对照组相比，小鼠的血肌酐水平升高(t=2.740,P=0.0255)；RIPC组与IR组比较，小鼠的血肌酐水平下降(t=2.341,P=0.0473)，补充3组数据，见图1-a。

2.2小鼠肾组织STAT3蛋白检测结果 采用Western blot方法对各组小鼠肾组织样本进行STAT3蛋白检测，得到相应蛋白条带结果，见图1-b。对照组小鼠肾组织的STAT3蛋白比值为(0.9360±0.2728)，IR组的蛋白比值为(1.6893±0.2971)，RIPC组小鼠的蛋白比值为(0.8900±0.2373)，组间比较，发现IR组与对照组相比，小鼠肾组织STAT3水平升高(P<0.05)；RIPC组与IR组比较，小鼠肾组织STAT3水平下降(P<0.05)，见图2。

3 讨论

本研究在小鼠肾缺血再灌注模型中验证了缺血再灌注可以导致肾损伤，远隔缺血预处理可以减轻缺血再灌注导致的肾损伤。检测小鼠肾组织中STAT3水平，发现缺血再灌注后STAT3水平升高，经远隔缺血预处理后，STAT3水平下降。说明STAT3表达下降可能与RIPC保护肾缺血再灌注损伤有关，RIPC可能通过抑制STAT3表达减轻肾损伤。

目前研究认为氧化应激与CIN的发生有关[6]。氧化应激状态产生的活性氧可以直接使线粒体Bax/Bcl-2升高，导致线粒体膜通透性增加，继而引起细胞凋亡[7]。在造影剂诱导的AKI动物模型中观察到，通过使用血红素加氧酶-1可以使Bax/Bcl-2比率降低，促凋亡蛋白caspase-3活性被抑制，从而减轻氧化应激引发的凋亡和肾功能障碍。在MAPK途径中，ROS能够诱发JNK和p38磷酸化，进而激活caspase增加细胞凋亡。Michele等人研究发现，造影剂可以激活p38、JNKs和NF-kB通路，引发STAT3磷酸化水平增加，导致HK-2细胞活力下降[8]。在造影剂诱导的大鼠模型中，通过使用抗氧化剂N型乙酰半胱氨酸，能减少JNK和p38磷酸化和凋亡发生[9]。史永红等发现抑制JAK-STAT信号途径后可减少TGF-β1表达，减少细胞外基质蛋白的生成，减轻细胞的增殖状态，从而产生的肾保护作用[10]。当前学者对JAK2/STAT3途径研究较为充分，高糖环境、血管紧张素Ⅱ、氧化应激均能激活JAK2/STAT3通路，引发糖尿病肾病患者组织炎症[11]。王珂等的研究也证实了上调STAT3可以加重缺血缺氧诱导的组织损伤[12]。本研究也显示STAT3水平升高可以加重肾缺血再灌注损伤。

本研究结果提示在CIN早期RIPC抑制STAT3表达，RIPC的肾保护作用部分是通过抑制JAK/STAT信号途径实现的。为了更好了解STAT3在CIN中的作用及具体机制，还需要大量研究。