338例少弱精、无精子症患者ICSI助孕结局分析

刘 丽 曹晓敏 张暄琳 邸建永 徐凤琴

天津市第一中心医院生殖医学科（天津 300192）

据资料统计在育龄夫妇中不孕不育夫妇约占15%，其中有30-50%为男方因素不育[1]。卵胞浆内单精子注射技术（intracytoplasmic sperm injection ICSI）解决了多数男性不育问题，对精子的数量、质量要求均大为降低。理论上只要获取一个活的精子，结合辅助生殖技术，就可能受精、妊娠。无精子症患者通过外科手术取精并借助辅助生殖技术可以拥有自己的遗传学后代。梗阻性无精子症（obstructive azoospermia OA）患者可通过经皮附睾穿刺取精术 （percutaneous epididymal sperm aspiration PESA）、非梗阻性无精子症患者 （non-obstructive azoospermia NOA）通过睾丸精子抽吸术（testicular sperm aspiration TESA）获取精子[2]，但部分患者通过TESA仍不能获得精子，随着男科手术技术的发展，睾丸切开显微取精术 （microdissection testicular sperm extraction MD-TESE）日渐普及，目前MD-TESE结合ICSI已经成为治疗NOA的金标准。为此类患者带来生育自己后代的希望，由于不同来源精子的发育成熟过程及成熟度均不相同，文献对射出精子、附睾穿刺精子及睾丸穿刺精子的助孕结局报道不一[3,4]，MD-TESE与少弱精子组、重度少弱精子组、PESA、TESA行ICSI的临床结局的报道较少。本结果选择单纯男方因素不孕而行ICSI助孕治疗患者作为分析对象，旨在为临床治疗提供依据。

资料与方法

一、研究对象及分组

回顾性分析2015年1月至2019年11月在我院生殖医学科接受ICSI治疗共338周期。入选标准：（1）夫妻双方染色体均正常；（2）女方年龄≤38岁，月经周期规律，基础FSH＜15mU/mL）；（3）男方因素不孕。排除标准：（1）早补救 ICSI，晚补救 ICSI，前次 IVF 受精失败行ICSI（2）女方子宫肌瘤、子宫内膜异位症等；依据精子质量分为少弱精子组167例、重度少弱精子组92例，无精子症分为PESA组33例，TESA组24例，MD-TESE组22例。本研究获天津市第一中心医院伦理委员会批准(伦理批号2019N069KY)，所有受试者均签署知情同意书。

二、方法

（一）促排卵方案及取卵

采用常规长方案、短方案或拮抗剂方案控制行卵巢刺激，当至少有2个优势卵泡直径达到17mm，肌注绒毛膜促性腺激素5000-10000IU，36小时后在B超引导下经阴道后穹隆穿刺取卵。卵子培养3h，透明质酸酶消化去除卵冠丘复合物外的颗粒细胞，排出第一极体的成熟卵子（MII）待行ICSI。

（二）精子获取及处理

常规射精：患者禁欲2～7天，取卵当日采用手淫方法留取精液标本，应用密度梯度离心法或直接离心法处理精液，收集活动精子待行ICSI。少弱精子症和重度少弱精子症诊断标准参考WHO人类精液检查与实验室处理手册(第5版)，即男方3次精液常规检查至少2次符合以下任一标准：1.精子浓度<15×106/ml；2.前向运动精子百分率<32%；重度少弱精子症：1.精子浓度<5×106／ml；2.前向运动精子百分率 <10%；

MD-TESE及TESA：将获取的睾丸组织置于解剖显微镜下，用两支1ml注射针撕碎睾丸组织，去除黏附的血块、杂质，划破并挤压曲细精管，使精子被分离出来，在倒置显微镜下检测有无精子。若有精子，收集含精子的洗涤液，室温孵育40-60min，待大块组织沉淀，吸取上层液离心1000rpm 10min，行直接离心法处理，精子悬液放入37℃培养箱内孵育待行ICSI。

PESA：患者经皮附睾精子抽吸术，取出附睾液体，倒置显微镜下镜检有无活动精子，有活动精子行直接离心法处理，放入37℃培养箱内孵育待行ICSI。

（三）受精、胚胎评估

常规行ICSI受精，16-18h观察原核，双原核和两个极体为正常受精。

（四）胚胎移植

根据卵裂球的数目，均一性及碎片比例评分，第三天7-9细胞I-II级胚胎为优质胚胎。选择1-2个优质胚胎移植，冷冻1-2个优质胚胎，剩余胚胎进行囊胚培养。

（五）妊娠判定及观察指标

移植14天后行尿、血绒毛膜促性腺激素测定确定是否妊娠，移植后28天阴道B超检查，见孕囊及心血管搏动为临床妊娠。

（六）观察指标

2PN受精率=D1 2PN数/MⅡ卵子数；优质胚胎率=优质卵裂胚胎总数/2PN卵裂胚胎数；可利用胚胎率=移植胚胎数+冷冻胚胎数/2PN卵裂胚胎数；囊胚形成率=2期及2期以上囊胚数/行囊胚培养的卵裂期胚胎数；临床妊娠率=临床妊娠周期数／移植周期数×100%；种植率=B超下见孕囊数／移植胚胎数×100%；早期流产率=妊娠12周流产的周期数／临床妊娠周期数×100%；

（七）统计学处理

采用SPSS19.0软件进行统计学分析，符合正态分布的计量资料以均数±标准差(Mean±SD),组间比较进行t检验。分类变量以率(%)表示，组间比较采用X2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、各组患者临床基础资料比较

五组患者男、女方年龄、女方抗缪勒氏管激素水平、体质量指数BMI、基础卵泡刺激素（FSH）、促性腺激素（Gn）使用天数、Gn总量、移植前内膜厚度、平均获卵数、MII卵数、平均移植胚胎数差异均无统计学意义（P＞0.05）见表 1。

表1 五组患者临床基础资料

二、五组患者临床结局比较

MD-TESE组与其他四组相比，2PN受精率差异有统计学意义（P＜0.05），少弱精子、重度少弱精子、PESA、TESA组2PN受精率相比差异无统计学意义 （P＞0.05）；各组间优质胚胎率、可利用胚胎率、囊胚形成率、早期流产率差异无统计学意义（P＞0.05）；重度少弱精子组临床妊娠率、种植率低于其他四组，但差异无统计学意义（P＞0.05），见表 2。

表2 五组患者临床结局比较

讨 论

1992年ICSI技术[5]的应用使精液质量差及无精子症的患者均可通过ICSI获得妊娠，射精获得精子和通过手术从附睾或睾丸获得精子相比较，理论上其核成熟度、精子运动能力及膜表面蛋白分子存在差异，不同来源的精子是否影响胚胎发育及临床妊娠结局备受关注。

本研究少弱精子、重度少弱精子、PESA、TESA组相比2PN受精率、优质胚胎率、可利用胚胎率、囊胚形成率、早期流产率差异无统计学意义。冯翠娥等[6]比较射出精子组、附睾穿刺精子组及睾丸精子组的受精率、临床妊娠率和早期流产率，差异无统计学意义。我们的结果与文献报道相符[7]。精子从产生到排出体外，在体内经历了睾丸和附睾内的一系列成熟过程，附睾是精子成熟的主要场所，包括精子核的成熟、顶体外膜抗原分布改变以及精子质膜通透性改变等，最终才能使精子获得运动能力及受精能力。ICSI避开了常规受精过程中精子获能、精子与卵子透明带识别黏附、顶体反应、精子与卵胞膜融合等步骤，人为选择单一精子直接注射入卵胞浆内完成受精，PESA组患者不孕原因多为输精管梗阻，自身生精功能无明显异常。睾丸精子成熟率低、密度少、活动力差，但不影响其所形成胚胎的发育潜能，选用形态正常的活动精子借助ICSI，仍然可以获得高的受精率、种植率、临床妊娠率。

重度少弱精子组的临床妊娠率、种植率低于其他四组，但差异无统计学意义（P＞0.05）。由于重度少弱精子患者睾丸生精功能低下或障碍或基因缺陷、阴囊血运异常、内分泌紊乱或免疫因素引起的精子生成过程异常，表现为严重的精子数量、活动力、形态及遗传物质异常，造成精子数目过少、活力差，且精液中包含大量白细胞、受损精子及未成熟精子，使精液中活性氧水平大大增高，极易诱发氧化应激[8]，导致精子DNA碎片率增高，精子功能降低[9]，妊娠率下降。Gharagozloo等[10]报道也认为，从氧化应激反面方面来考虑，严重少、弱精子症患者精液中由于未成熟精子、损伤精子、形态异常精子及过量白细胞等的存在而导致精液中活性氧水平增加并引起氧化应激反应，而氧化应激诱导的精子损伤影响受精后的胚胎发育能力。

非梗阻性无精子症约占无精子症人群的60%[11]，是男性不育中最严重的一种疾病，是由于各种原因导致的睾丸生精功能衰竭，精子发生障碍[12]，传统TESA只是随机获取部分睾丸组织或生精小管，未获精的患者只能依靠供精。近年研究显示睾丸精子发生是局灶性和不均一的，即使睾丸大部分生精小管内未找到精子，并不能排除小部分生精小管内存在精子，由于NOA存在局灶性生精的理论基础，MD-TESE在显微镜下操作，可以直接辨别可能含有精子的白色不透明的生精小管，更具有针对性。NOA患者通过MD-TESE成功获得精子概率为20%～60%[13]，比TESA有更好获精率和更少的术后并发症[14，15]。MD-TESE结合ICSI使这些患者能有自己的生物学后代[16，17]。MD-TESE与其他来源精子ICSI结局比较鲜见报道。本研究MD-TESE组2pn受精率73.02%，低于其他四组，差异有统计学意义。这是由于显微取精局部生精小管中获精与TESA患者相比，睾丸生精能力更差，取出的精子极少，畸形率高，成熟精子比例较低，影响卵子激活，从而影响正常受精。Hatsuki等[18]报道显微取精受精率73.5%，我们的结果与报道一致。MD-TESE组与其他组比较虽然受精率较低但优质胚胎率、可利用胚胎率、囊胚形成率、临床妊娠率、种植率、早期流产率差异无统计学意义（P＞0.05），说明睾丸精子已经完成减数分裂，成为已携带父源遗传物质的单倍体和受精卵形成必需的中心粒，具备了使卵子受精后进一步卵裂、发育形成正常胚胎的能力。刘贵华等[19]比较了显微取精和重度少精子症患者种植率和临床妊娠率差异无统计学意义。孙建华[20]报道ICSI周期MD-TESE的NOA患者和睾丸穿刺取精术的OA患者的优质胚胎率、临床妊娠率，流产率差异无统计学意义。说明不同来源的精子受精之后的胚胎发育潜能相似。

综上所述，少弱精子、重度少弱精子及PESA、TESA、MD-TESE结合ICSI均可作为男方不育患者的助孕手段，单纯男方因素不育患者无论是来源于睾丸、附睾，还是严重少弱精子症患者射出的精子行ICSI，对妊娠结局无明显影响。只要能获得一定数量和质量较好的可移植胚胎，均可获得满意的临床妊娠结局。此外由于本研究样本量小，数据仅限于胚胎植入后的临床妊娠、胚胎早期发育，仍需进一步扩大样本量随访胎儿发育及出生结局。