锌转运蛋白在糖尿病雄性大鼠性腺组织中的表达

刘文娇 马 婧 韩瑞钰 王树松,

1河北师范大学化学与材料科学学院（河北石家庄 050021）；2．河北省计划生育科学技术研究院，国家卫生和健康委员会计划生育与优生重点实验室/河北省生殖医学重点实验室（河北石家庄 050071）

锌是人类机体生长发育必需的微量元素之一，是人体内300多种酶和转录因子的重要组成成分，直接参与核酸和蛋白质的合成、细胞的分化和增殖以及许多重要的代谢，在生殖系统中发挥着重要的作用，缺锌导致男（雄）性生育力下降。研究表明，锌稳态的精确控制对于维持机体健康和预防疾病至关重要，糖尿病患者体内存在锌稳态失衡[1]。锌离子的平衡主要由锌转运蛋白ZnTs家族和Zips家族两个家族完成的，前者能将锌离子由胞质中转运到胞质外，后者则将锌离子由胞质外转运到胞质中[2]。因此，本文观察了糖尿病雄性大鼠生殖性腺中锌转运蛋白的变化，阐明锌转运蛋白在糖尿病雄性生殖系统中的作用。

材料与方法

一、实验方法

（一）动物模型构建及分组

6周龄健康雄性SD大鼠20只，随机分为对照组和糖尿病（DM）组，对照组给予普通饲料喂养并于8周后一次性注射0.2mL枸橼酸钠缓冲液；DM组给予高脂高糖饲料喂养，8周后一次性腹腔注射30mg·kg-1链脲佐菌素，1周后以空腹血糖大于11.7mmol/L视为造模成功，于造模后处死并留取性腺组织，性腺组织一半置于10%福尔马林液中固定，剩余组织立即放入液氮中，然后转入-80℃冰箱保存待用。实验动物购于河北医科大学实验动物中心。

（二）大鼠精子浓度和活力的检测

取新鲜大鼠左侧附睾尾部，置于装有生理盐水的EP管中，用眼科剪充分剪碎，37℃孵育10min，使精子充分溢出，取10μl置入精子计数板中，记录精子浓度和活力。

（三）HE 染色

大鼠睾丸、附睾、精囊、前列腺等组织在10%福尔马林中固定24h后，常规石蜡包埋，切片。常规脱蜡复水；苏木素染色6min，自来水冲洗，盐酸酒精分化3s，自来水冲洗，0.1%氨水返蓝3s，自来水冲洗，伊红染色8min，自来水冲洗；脱水脱蜡：100%酒精Ⅰ、Ⅱ各5min，脱蜡剂Ⅰ、Ⅱ各5min，中性树胶封片。

（四）免疫组织化学

常规脱蜡复水。PBS洗3次，每次5min。柠檬酸钠-EDTA抗原修复，室温自然冷却，PBS洗3次，每次5min。3%过氧化氢孵育40min，PBS洗3次，每次5min。山羊血清封闭1h。滴加一抗（其中对照用1×PBS，ZnT1和ZnT8以 1：100比例稀释，Zip1以 1:200的比例稀释，Zip2以1:400的比例稀释），4℃过夜。PBS洗涤3次，滴加生物素标记山羊抗兔IgG二抗工作液，室温孵育1h，PBS洗涤3次，滴加辣根酶工作液并室温孵育30min，PBS洗涤3次，DAB显色，苏木素复染，中性树胶封片。阳性染色为棕黄色。

（五）实时定量PCR检测

用RNA提取试剂盒（ZP404，北京庄盟国际）分别提取睾丸、附睾、精囊、前列腺等组织的总RNA，按照说明书逆转为cDNA，以cDNA为模板进行实时荧光定量PCR扩增ZnT1、ZnT8、Zip1和Zip2。PCR反应条件如下：95℃预变性 3min，95℃30s、62℃30s、72℃30s，共35个循环，在72℃30s处收集荧光信号，72℃延伸5min。分别以正常大鼠组织为1倍目的基因表达量的校准样品，根据2-△△ct计算糖尿病组大鼠组织中各目的基因mRNA的相对表达

β-actin 引 物 序 列 ：5′-ACCCGCGAGTACAACCTTCT-3′，5′-GATGCCTCTCTTGCTCTGGG-3′;

ZnT1 引物序列：5′-GCAGAGAAGGCTCCAACA GT-3′,5′-ATTCGGGCTGTTTGTTTGGC-3，;

ZnT8 引物序列：5′-GCACTGATGTAGGACGCA CT-3′，5′-CAGGCTTCTGTCCACGTTCT-3′;

Zip1 引物序列 ：5′-GCCTTGGAGGCTCTTCATGT-3′，5′-AAGCCAGTGTGATCTGCTCC-3′;

Zip2 引 物 序 列 ：5，-CTGCATCCGTCTGGAACCAT-3′，5′-ATGGTTCCAGACGGATGCAG-3′;

（六）Western Blot

称取性腺组织0.1g，每管加入裂解液500μl。超声裂解5min。低温离心取上清，用BCA试剂盒（PQ0012，杭州联科生物）测蛋白浓度。凝胶电泳，80V恒压30min左右，待电泳至浓缩胶底部时，将电压转置120V，电泳约60min。恒流200mA电泳转膜1.5h。5%脱脂奶粉封闭1.5h。一抗孵育（其中ZnT1、ZnT8、Zip1和Zip2以1:1000的比例稀释，内参β-actin以1:10000的比例稀释）4℃过夜。用1×TBST溶液膜洗3次，每次10min。二抗（以1:8000的比例稀释）摇床孵育1.5h。1×TBST洗两次，1×TBS洗1次，每次洗10min。ECL化学发光液显影，采用Image J软件分析目的条带的灰度值和内参条带的灰度值。

二、统计学处理

采用SPSS21.0软件进行分析，计量资料以均值±标准差（x±s）表示，符合正态分布进行t检验分析，P<0.05为差异具有统计学意义。

结 果

一、大鼠一般情况

第9周时，糖尿病组10只大鼠中7只大鼠空腹血糖＞11.7mmol/L，造模成功率为70%。实验结束时，糖尿病组大鼠体重、空腹血糖(Fasting Blood Glucose,FBG)，甘油三酯(Triglyceride,TC)，总胆固醇（Total cholesterol,TC），低密度脂蛋白胆固醇 （Low Density Liporotein Cholesterol,LDL-C)均显著高于对照组，高密度脂蛋白胆固醇 （High Density Lippoorotein Cholesterol,HDL-C）显著低于对照组，具有统计学意义（P<0.05）。糖尿病组大鼠精子浓度和精子活力显著低于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。

表1 实验结束时两组大鼠血糖血脂、精子参数的情况（x±s）

二、两组大鼠睾丸、附睾、精囊、前列腺等组织的HE染色（见图1）

睾丸：对照组大鼠睾丸生精小管内的不同种类的细胞有序排列，结构比较完整，有大量精子存在。糖尿病组大鼠睾丸中的生精小管内，有些间质细胞结构发生破坏，组织中间出现空泡现象，精子数量减少。

附睾：对照组大鼠附睾管内均匀分布大量精子，并无规则地排列着，染色较深，同时组织细胞内的核和胞质清晰可见。糖尿病组大鼠附睾内精子数量明显减少，在附睾上皮细胞出现了空泡样的变化以及部分主细胞的胞核发生溶解破裂的现象。

精囊：对照组大鼠精囊腺腔内含有嗜伊红分泌物，腺腔内有许多褶皱。糖尿病大鼠精囊腺腔内褶皱减少。

前列腺：对照组大鼠前列腺为薄上皮、内壁光滑，胞质染色较深并且比较完整。糖尿病组大鼠前列腺内壁褶皱增多，上皮增生，疏松结构发生改变。

图1 两组大鼠睾丸、附睾、精囊、前列腺组织的HE染色（标尺=20μm）

三、免疫组织化学分析锌转运蛋白在两组大鼠性腺组织中的定位和表达（见图2）

睾丸：在大鼠睾丸中ZnT1在质膜、间质细胞以及生精细胞细胞质内表达，糖尿组明显低于对照组；ZnT8在睾丸间质细胞和生精细胞胞质中均有表达，糖尿病组明显高于对照组；Zip1和Zip2在睾丸生精细胞细胞质中表达，糖尿病组明显低于对照组。

附睾：ZnT1和Zip1表达在附睾腔内细胞质中，糖尿病组高于对照组；ZnT8表达在附睾管内上皮细胞、附睾上皮基底部细胞以及腔内胞质中，糖尿病组高于对照组；Zip2表达在附睾管顶细胞以及腔内胞质中，糖尿病组低于对照组。

精囊：ZnT1、ZnT8、Zip1 和 Zip2 均在大鼠精囊腺上皮细胞的胞浆和胞膜上表达。糖尿病组ZnT1、Zip1表达明显低于对照组，ZnT8两组之间表达相反，Zip2在两组表达相近。

前列腺：ZnT1、ZnT8、Zip1 和 Zip2 在大鼠前列腺中表达在前列腺上皮细胞的胞浆与胞膜中，糖尿病组较对照组表达均稍高。

图2 免疫组织化学法检测ZnT1、ZnT8、Zip1、Zip2在两组大鼠睾丸、附睾、精囊、前列腺组织中的表达（标尺=20μm）

四、Western blot检测锌转运蛋白在两组大鼠性腺组织中的蛋白水平表达（见图3）

图3 两组大鼠性腺组织Znt1、Znt8和Zip1和Zip2蛋白表达情况

ZnT1：在糖尿病组睾丸和精囊中表达水平明显低于对照组 （P<0.05），在附睾中表达显著高于对照组（P<0.05）。

ZnT8：在糖尿病组睾丸、附睾、精囊和前列腺组织中均高于对照组（P<0.05）。

Zip1：在糖尿病组睾丸和精囊组织中低于对照组（P<0.05），在附睾中表达显著高于对照组（P<0.05），在前列腺中未见明显差异（P>0.05）。

Zip2：在糖尿病组附睾中明显低于对照组（P<0.05），其它组织中未见明显差异。

五、RT-PCR分析锌转运蛋白在两组大鼠睾丸、附睾、精囊、前列腺等组织中mRNA表达（见图4）

图4 两组大鼠性腺组织Znt1、Znt8和Zip1和Zip2 mRNA的表达

ZnT1：糖尿病组大鼠睾丸、精囊中ZnT1 mRNA的表达较对照组下降，在附睾、前列腺中升高，具有统计学意义（P<0.05）。

ZnT8：糖尿病组大鼠睾丸、附睾、精囊、前列腺中ZnT8 mRNA的表达较对照组增加，具有统计学意义（P<0.05）。

Zip1：糖尿病组大鼠睾丸和精囊中Zip1 mRNA的表达较对照组明显降低（P<0.05），附睾和前列腺中表达较对照组明显升高（P<0.05）。

Zip2：糖尿病组大鼠附睾Zip2 mRNA的表达较对照组明显降低（P<0.05），前列腺组织明显升高（P<0.05）。

表2 两组大鼠性腺组织Znt1、Znt8和Zip1和Zip2蛋白和mRNA表达变化趋势汇总（与对照组相比，P<0.05）

讨 论

锌是人类必需的微量元素之一，锌与人体内近300种酶的活性有关，广泛参与核酸和蛋白质的代谢，因此也影响到各种细胞的生长、分裂和分化。缺锌可产生多种疾病。糖尿病是由环境因素、遗传因素共同作用引起的、以慢性高血糖为特征的代谢紊乱性疾病，低锌血症是糖尿病患者的普遍症状[3]。锌离子的稳态是由锌转运蛋白精密调控，锌转运体的正常分布对睾丸组织的保护起着重要作用，保证了锌在各种细胞中的合理分配，使锌发挥其正常的生理功能[4]。锌转运蛋白的表达改变不仅可能干扰细胞器中锌的稳态，还可能导致细胞器功能障碍，锌稳态失衡涉及人类疾病的发病机理[5,6]。

ZnT1是ZnT家族中最先被发现的锌转运体，是一种细胞膜蛋白，它能够将Zn2+从细胞浆中转运到细胞外，降低细胞浆内Zn2+的浓度，从而维持细胞内适宜的锌水平[7,8]。ZnT1还具有抑制锌通过L型钙通道内流的功能。Elgazar等[9]发现ZnT1存在于质膜中，同时存在于支持细胞的细胞质中。本研究显示，ZnT1在大鼠睾丸、精囊、附睾和前列腺组织中均有表达，糖尿病组大鼠睾丸和精囊中表达明显降低，附睾中表达明显增高。

ZnT8是ZnT家族的一个成员，ZnT8是一种特异存在于胰岛β细胞的锌转运体，其功能为向胰岛β细胞的胰岛素分泌小泡内转运锌离子，对于胰岛素的贮存和分泌十分重要。基础研究表明ZnT8能刺激胰岛素分泌，造成电压敏感性钙离子通道开放，导致钙离子流出和钙离子含量增加[10]。研究证实ZnT8在睾丸组织中也有表达，其功能可能与睾酮合成有关[11]。Zhang等[12]研究表明ZnT8存在于人和小鼠的睾丸间质细胞中，ZnT8基因敲除的小鼠血清睾酮水平远低于正常小鼠，表明ZnT8在睾酮生物合成中起到关键作用，还证实ZnT8通过影响蛋白激酶A（PKA）信号通路进而影响线粒体中的锌含量。本研究发现ZnT8蛋白和ZnT8 mRNA在大鼠睾丸、附睾、精囊和前列腺组织中均有表达，糖尿病组大鼠睾丸、附睾、精囊和前列腺组织中ZnT8表达均明显升高。结果说明，糖尿病对雄性大鼠各性腺及附性腺组织中ZnT8的影响是相同的，促进Zn2+从细胞浆中转运到细胞外，降低细胞浆内Zn2+的浓度。

锌铁转运蛋白ZIP家族(SLC39)是一类介导锌摄入的跨膜蛋白,目前已在人体中发现14个成员(ZIP1～14)。ZIP1和Zip2位于细胞膜，当细胞浆游离锌缺乏时，ZIP1、Zip2从细胞外转运锌离子进入细胞浆，以维持细胞的锌稳态。有研究表明Zip1和Zip2在相同的细胞类型中共存，它们之间还能相互作用形成异质多聚体[13]。Franz等[14]认为Zip2是一种促进的二价金属离子转运蛋白，可以通过细胞外pH和膜电位调节，并且H+介导的调节机制可能对确定运输速度和方向具有重要作用。本研究发现，Zip1和Zip2在雄性大鼠性腺组织中均有表达；糖尿病大鼠Zip1和Zip2 mRNA在前列腺组织中均显著升高，Zip1mRNA、Zip1蛋白在糖尿病大鼠睾丸和精囊组织中呈现下调，在附睾中表达上调；Zip2 mRNA、Zip2蛋白在糖尿病大鼠附睾组织中呈现下调，Zip2蛋白在精囊中上调、Zip2 mRNA在糖尿病大鼠前列腺组织中呈现上调。

Foster等[15]研究认为锌转运蛋白mRNA的相对表达 变 化 很 大 ，ZnT1、Zip1 表 达 最 丰 富 ，ZnT1 和Zip1mRNA彼此呈高度正相关关系，其在跨越质膜的锌转运中具有相互作用。本研究结果显示，ZnT1和Zip1mRNA和蛋白表达在雄性性腺组织中变化趋势也具有一致性，ZnT1和Zip1之间的相关性表明这两种锌转运蛋白具有高度协调作用。

综上所述，在雄性大鼠生殖性腺中ZnT1、ZnT8和Zip1、Zip2mRNA和蛋白都均有表达，这4个抗体的免疫组织化学也都具表达。ZnT1、ZnT8和Zip1、Zip2在糖尿病大鼠性腺中表达发生了变化，反映了组织内锌稳态的失衡，锌代谢紊乱对雄性大鼠生育力受损起到重要的作用。