天麻成分C血、脑微透析探针体内外回收率分析

李孟云 何晓山

摘要：目的 采用微透析取樣技术研究口服给予天麻成分C后血-脑药代动力学参数。方法 采用HPLC技术建立微透析样品中天麻成分C的分析方法，采用正透析法和反透析法研究天麻成分C在大鼠体内的血、脑微透析探针体内外回收率，考察灌流速度、药物质量浓度对探针体内外回收率的影响，以及探针回收率在大鼠体内外的稳定性。采用血-脑同步微透析进行体内药动学研究，HPLC测定透析液中天麻成分C的含量。结果 所建立的 HPLC分析方法，在要求范围内线性关系良好，色谱的专属性、精密度、基质效应等均符合要求。体内外回收率试验，采用正透析法和反透析法测得体外内回收率显示在恒定质量浓度下，血、脑微透析探针体内外回收率均随着流速的增大而减小，体外回收率基本保持一致，体内回收率低于体外回收率;恒定流速下，天麻成分C质量浓度对血脑探针体内外回收率均无影响;在恒定浓度和恒定流速的条件下，天麻成分C的血脑微透析探针在大鼠体内回收率在12 h内保持相对稳定，血脑探针回收率分别为（45.32±2.83）%，（10.55±0.82）%。结论 反透析法可以用来研究天麻成分C在大鼠体内的回收率，微透析技术能够用于天麻成分C在大鼠体内的血、脑药代动力学同步研究。

关键词：天麻;酚性成分;微透析;探针回收率;药代动力学

中图分类号：R285.5

文献标志码：A

文章编号：1007-2349（2020）10-0050-07

【Abstract】Objective： To study the blood-brain pharmacokinetic parameters after oral administration of Gastrodia elata component C by microdialysis sampling technique. Methods： HPLC was used to establish the analysis method of Gastrodia elata component C in microdialysis samples and the positive dialysis method and reverse dialysis method were used to study the recovery rate of Gastrodia elata component C in the blood-brain microdialysis probes in rats in vivo and in vitro， and to explore the effect of the perfusion speed and drug concentration on the recovery rate of the probe in vivo and in vitro and the stability of the recovery rate of the probe in vivo in rats. The pharmacokinetic study in vivo was carried out by blood-brain synchronous microdialysis and the content of Gastrodia elata component C in the dialysate was determined by HPLC. Results： The established HPLC analysis method had a good linear relationship within the required range and the specificity， precision and matrix effect of the chromatogram all meet the requirements. The recovery rate test in vivo and in vitro， by which the recovery rate was measured through positive dialysis method and reverse dialysis method， showed that the recovery rates in vivo and in vitro of blood-brain microdialysis probes all decreased with the increase of flow rate at a constant mass concentration. The recovery rate in vitro was basically the same， and the recovery rate in vivo was lower than the recovery rate in vitro. At a constant flow rate， the mass concentration of Gastrodia elata component C had no effect on the recovery rate of blood-brain probe in vivo and in vitro. Under the conditions of constant concentration and constant flow rate， the recovery rate of the blood-brain microdialysis probe of Gastrodiae elata component C in rats remained relatively stable within 12 hours. The recovery rate of the blood-brain probe was 45.32±2.83% and 10.55±0.82%， respectively. Conclusion： The reverse dialysis method can be used to study the recovery rate of Gastrodia elata component C in rats and the microdialysis technique can be used for the simultaneous study of the blood-brain pharmacokinetics of Gastrodia elata component C in rats.

【Key words】Gastrodia elata， phenolic components， microdialysis， recovery rate of probe， pharmacokinetics

天麻（Gastrodia elata Blume）为兰科植物天麻干燥的块茎，为我国常用名贵中药之一，多产于云南、四川、陕西及贵州等地[1]。代药理学研究表明其具有益智、脑保护、镇痛、镇静催眠、抗癫痫、抗晕眩、降压、降血脂、抗氧化、保肝、抗肿瘤、增强免疫力等多种药理作用[2]。课题组前期研究发现天麻具有较好的抗缺血性脑卒中的作用，主要的活性部位集中在乙酸乙酯部位，其中分离得到的一组酚性成分可通过抗神经细胞凋亡[3]、抗血小板聚集[4]、减轻钙超载[5]、抗自由基损伤及改善神经元突触可塑性[6-8]等机制发挥较强的抗大鼠脑缺血及脑缺血/再灌注损伤的作用[9];天麻系列酚性成分中，成分C结构相对稳定、活性强、安全性好[10]，有望开发成抗缺血性脑血管病的新药。

微透析（microdialysis）是近年发展起来的一种取样技术[11-13]，主要原理将探针埋置在特点的靶组织或部位，药物在探针半透膜两侧存在一定的浓度差，此时药物会顺浓度梯度扩散至半透膜内，并被连续不断地灌流液带出[14-15]。探针上的半透膜具有一定截留分子量，因此微透析探针具有一定的透过率，所得样品的药物浓度并不是组织中药物的真实浓度，需要通过探针回收率的矫正[16]，计算真实药物浓度。对此，本研究通过考察探针回收率的影响因素，确定适宜的条件，建立适用于测定天麻成分C血-脑微透析探针回收率的分析方法。

1 试验材料

1.1 试剂与药品 天麻成分C对照品（百顺化学科技有限公司，北京，批号：156765）;甲醇为色谱级（赛默飞世尔公司，批号：178500）;水合氯醛（天津市科密欧化学试剂有限公司，批号：20100926）;复方氯化钠注射液（即林格氏液，北京雷根生物技术有限公司，批号1010A19，规格：500 mL）;娃哈哈纯净水;其余试剂均为分析纯。

1.2 仪器 Agilent1260高效液相色谱仪（美国Agilent公司）;分析天平（赛多利斯科学仪器北京有限公司）;电子天平（余姚市金诺天平仪器有限公司）;ZS-FD型大鼠立体定位仪（北京众实迪创科技发展有限责任公司）;MD-2310/10 mm微透析血探针（美国BASi公司）;MD-2200/2 mm微透析脑探针及MD-2251套管（美国BASi公司）;MD1001 微量注射泵（美国BASi公司）;低温微量收集器（美国Basi公司）。

1.3 动物 SPF级SD雄性大鼠，180～200 g湖南斯莱克景达实验动物有限公司，合格证号 SCXK（湘）2016-0002。

2 方法与结果

2.1 测定条件 色谱条件：色谱柱为ZORBAX SB-C18（StableBond Analytical 4.6×250 mm 5-Micron，Agilent公司）;流动相甲醇（B）：水（D）=20：80，等度洗脱。流速0.5 mL·min-1;柱温25℃;进样体积10 μL。

2.2 溶液的配制 标准溶液的配制：精密称取天麻成分C对照品100 mg，置100 mL容量瓶中，加适量甲醇溶解定容至100 mL，混匀，得相应浓度的对照品甲醇溶液，取1mL对照品甲醇溶液，甲醇依次稀释为999.0，499.5，249.75，124.875，62.438，31.219，15.609，7.805，3.902和1.951 μg·mL-1的对照品储备液。取对照品储备液10 μL，分别加入90 μL的空白脑透析液中，涡旋混匀，得到含天麻成分C的标准品样品。同法制备含天麻成分C的高、中、低质控样品。

供试品溶液的配制：精密称取天麻成分C对照品10 mg置烧杯中，加适量林格氏液，超声溶解，定容至100 mL容量瓶中，摇匀，制备成含天麻成分C浓度为0.1 mg·mL-1的供试品储备液，精密吸取一定体积的供试品储备液用林格氏液将其稀释成质量浓度为50，25，12.5，6.25和3.125 μg·mL-1的天麻成分C林格式液，临用前新鲜配制。

2.3 脑、血液微透析探针的植入

2.3.1 脑微透析探针的植入 SD大鼠腹腔注射质量浓度为100 g·L-1的水合氯醛麻醉，头部剃毛，将大鼠头部固定于立体定位仪上，沿脑正中剪开头皮，用双氧水去除头骨上的膜，暴露头骨，在大脑右侧皮层对应的点（前囟前后+3.2 cm，中缝左右+ 0.4 cm，颅骨平面上下-3.0 cm）标记并用顱钻打孔，另钻两孔拧入螺丝钉，在皮层对应的点植入脑微透析探针套管，用牙科水泥将套管连同2个螺钉一并固定。待牙科水泥牢固后，松开立体定位仪，手术区域前后各缝皮1针。手术后恢复3 d，正常进食进水。进行微透析实验前用林格氏液灌流10 min，排出探针半透膜上的甘油，取出大鼠脑部探针套管的假针，插入微透析探针，以一定的灌流速度开始灌流，平衡60 min后进行微透析取样[17]。

2.3.2 血液微透析探针植入 SD大鼠腹腔注射质量浓度为100 g·L-1的水合氯醛麻醉，颈部剃毛，将大鼠仰卧固定于手术台上，沿颈部中线靠右约0.5 cm处剪开约1.5 cm，钝性分离颈静脉，颈静脉远心端结扎，在远心端剪一小口，将血液探针朝心脏方向插入，探针半透膜应全部没入血管内，将探针上的网状物与两旁的肌肉组织缝合从而固定探针，缝皮，以一定的灌流速度开始灌流，平衡60 min后进行微透析取样[18-19]。

2.4 方法学考察

2.4.1 专属性 分别取6只老鼠的空白血透析液和脑透析液10 μL采用HPLC进行检测的色谱图（A）和色谱图（B），取含天麻成分C的对照品溶液10 μL按2.1项下条件进行检测，得色谱图（C），取含天麻成分C的血透析液样品和脑透析液样品10 μL按2.1项下条件进行检测，得色谱图（D）和色谱图（E）和结果表明，在此色谱条件下，测定的天麻成分C峰形良好，保留时间约为13.4 min，测定不受干扰，如图1。

2.4.2 线性及标准曲线 制备含天麻成分C浓度为99.90，49.95，24.98，12.49，6.24，3.12，1.56，0.78，0.39和0.20 μg·mL-1的标准品溶液，各取30 μL按2.1项下条件进行检测，以峰面积为纵坐标（Y），对应浓度为横坐标（X），做回归曲线，所得天麻成分C的回归方程为：Y=27.46044+74.13301X（R2=0.99925）线性范围为：0.20～99.90 μg·mL-1。

2.4.3 精密度和准确度 按2.2项下配制含天麻成分C高（12.49 μg·mL-1）、中（6.24 μg·mL-1）、低（0.78 μg·mL-1）3个浓度的质控样品，每个浓度平行配制5份，取30 μL，按2.1项下条件进行检测。1 d内平行操作，5次，考察日内精密度。连续进样3 d，考察日间精密度，其RSD值应≤15%，RE应≤15%。结果显示，高、中、低日内精密度的分别为4.31%，1.99%和4.73%，准确度在85%～104%范围内。日间精密度分别为8.57%，7.04%和4.10%，准确度在86%～110%范围内。均符合要求。结果见表1。

2.4.4 基质效应 按2.2项下配制含天麻成分C高（12.49 μg·mL-1）、中（6.24 μg·mL-1）、低（0.78 μg·mL-1）3个浓度浓度的质控样品，每个浓度各3份，取30 μL，按2.1项下条件进行检测，记录峰面积A1。另取水代替空白透析液，按上述方法，配制含天麻成分C高（12.49 μg·mL-1）、中（6.24 μg·mL-1）、低（0.78 μg·mL-1）3个浓度浓度的质控样品各3份，涡旋混匀，取30μL，按2.1项下条件进行检测，记录峰面积A2。以上述方法所得峰面积比值（A1/A2）计算基质效应。结果显示，结果表明天麻成分C在低、中、高3个质量浓度的基质效应分别是109.69 %，98.26%，109.89 %;均在85%～120%范围内，且RSD≤15%，无明显基质效应。

2.4.5 稳定性 按2.2项下配制含天麻成分C高（12.49 μg·mL-1）、中（6.249 μg·mL-1）、低（0.789 μg·mL-1）三个浓度浓度的质控样品，每个浓度各3份，分别考察室温下8 h，-80℃下放置14 d，反复冻融3次，按2.1项下条件进行检测，记录峰面积，其RSD≤15%。结果显示天麻成分C高、中、低三个质量浓度在以上三种条件下均能保持稳定，RSD均≤15%。结果见表2。

3 脑、血液微透析探针回收率试验

微透析探针回收率的测定有2种常用的方法，即正透析法和反透析法，正透析法能够反映透析针的真实回收率，反透析法则用于评价体内回收率和真实回收率的一致性[20-21]。因此采用正透析法测定探针体外回收率，反透析法测定探针体内回收率。微透析探针回收率受到多种因素的影响，本次实验选择灌流速度，浓度、探针稳定性等因素考察血-脑微透析探针的体内外回收率。

3.1 灌流速度对探针体内外回收率的影响 分别采用正透析法和反透析法测定并计算天麻成分C的血-脑微透析探针的体外回收率。采用正透析法考察灌流速度对天麻成C血、脑微透析探针体外回收率的影响。将血探针和脑探针分别浸没在含有12.5 μg·mL-1天麻成分C的林格式液中，水温维持在 37 ℃，用空白林格式液分别以流速1，1.5，2和3 μL·min-1灌注探针，每组先平衡60 min后，收集5次微透析样品（每次30 μL），再取含药的林格式液为原药液为原药液，经HPLC测定得透析液浓度（Cdialysate）和原液浓度（C0），并计算正向回收率（positive recovery），Rpositive=Cdialysate/C0×100%，结果见图2。采用反透析法考察灌流速度对天麻成C血、脑微透析体外探针回收率的影响。将血探针和脑探针分别浸没在空白林格式液中，水温维持在 37 ℃，用含有12.5 μg·mL-1天麻成分C的林格式液分别以流速1，1.5，2和3 μL·min-1灌注探针，每组先平衡60 min后，收集5次微透析样品（每次30 μL），再取含药的林格式液为原药液，经HPLC测定得透析液浓度（Cdialysate）和原液浓度（C0），并计算反向回收率（reverse recovery），Rreverse=（C0-Cdialysate）/C0× 100%。结果见图2，以上结果显示当流速在1～3 μL·min-1时血、脑微透析探针体外回收率均随着流速的增大而减小，表明探针回收率与流速密切相关，且相同探针其正透析法和反透析法所测得的体外回收率基本一致，血探针回收率始终大于脑探针回收率。

采用反透析考察灌流速度对天麻成C血、脑微透析体外探针回收率的影响。按照2.3项下方法植入脑、血液微透析探针，用含有12.5 μg·mL-1的天麻成分C林格式液分别以1，1.5，2，3 μL·min-1的流速灌注探针，平衡60 min后开始收集，收集5次微透析样品（每次30 μL）再取含药的林格式液为原药液，经HPLC测定得透析液浓度（Cdialysate）和原液浓度（C0），并计算反向回收率（reverse recovery），Rreverse=（C0-Cdialysate）/C0× 100%。结果见图3，结果显示当流速在1～3 μL·min-1时血、脑微透析探针体内回收率均随着流速的增大而减小。

3.2 质量浓度对探针体内外回收率的影响 采用正透析法分别将脑、血探针置于含有一定质量浓度25，12.5，6.25和3.125 μg·mL-1的天麻成分C林格式液中，恒温37℃，用空白林格式液以2 μL·min-1的流速灌注探针，每个浓度在平衡60 min后，开始收集样品，连续收集5份样品，每份30 μL。取含药的林格式液为原药液，经HPLC测定得透析液濃度（Cdialysate）和原液浓度（C0），并计算正向回收率（positive recovery），Rpositive=Cdialysate/C0×100%。 结果见图4，结果显示当灌流速度一定时，在4种不同浓度的含药林格式液中，血脑微透析探针回收率基本保持一致，体外探针回收率不会随着浓度的改变有太大变化，表明天麻成分C浓度为3.125～25 μg·mL-1时，血、脑微透析探针对天麻成分C的体外回收率与浓度无关。

采用反透析法对探针体内回收率的稳定性进行考察。按照2.3项下方法植入脑、血液微透析探针，用含有一定质量浓度25，12.5，6.25和3.12 μg·mL-1的天麻成分C林格式液以2 μL·min-1的流速灌注探针，平衡60 min后开始收集，收集5次微透析样品（每次30 μL），取含药的林格式液为原药液，经HPLC测定得透析液浓度（Cdialysate）和原液浓度（C0），并计算反向回收率（reverse recovery），Rreverse=（C0-Cdialysate）/C0× 100%。结果见图4，结果表明结果显示当灌流速度一定时，在4种不同浓度的含药林格式液中，血脑微透析探针回收率基本保持一致，体内探针回收率不会随着浓度的改变有太大变化，表明天麻成分C浓度为3.125～25 μg·mL-1时，血、脑微透析探针对天麻成分C的体内回收率与浓度无关。

3.3 微透析探针体内外回收率的稳定性考察 采用反透析法分别对血脑微透析探针体内回收率的稳定性进行考察。按照2.3项下方法植入脑、血液微透析探针，用含有12.5 μg·mL-1的天麻成分C林格式液以2 μL·min-1的流速灌注探针，平衡60 min后开始收集，每60 min收集一次，连续收集12 h，取含药的林格式液为原药液，经HPLC测定得透析液浓度（Cdialysate）和原液浓度（C0），并计算反向回收率（reverse recovery），Rreverse=（C0-Cdialysate）/C0× 100%。结果见图5，结果表明，在恒定流速恒定浓度的情况下，血-脑微透析探针的体内外回收率在12h内有较小的波动，总体保持相对稳定。血、脑微透析探针对天麻成分C的体内回收率分别 10.55% 和45.32%。

4 讨论

微透析是一门可以对动物靶组织或靶器官进行活体研究的技术，完整的微透析系统由微量泵、探针、收集器组成，作为其核心部分的探针在整过实验中起关键作用。将探针埋置于特定靶组织或靶器官时，此时由于灌流也不断地经过半透膜，此时半透膜外侧的物质会顺浓度梯度透过半透膜，被连续不断的灌流带出，这是一个透过的过程，由于物质透过的并不完全，因此在使用此技术进行定量分析，就要先解决探针透过率即回收率的问题。本实验为了天麻成分C的后续研究，首先对天麻成分C血、脑微透析探针的体内外回收率进行研究，分别考察了灌流速度、质量浓度对探针回收率的影响，同时对探针体内稳定性进行了研究。表明当灌流流速为2 μL·min-1时，天麻成分C血、脑微透析探针的体内回收率分别为45.32%和10.55%，说明微透析技术是可以用于天麻成分C在大鼠体内的药动学研究。从灌流速度的考察结果中可以看出灌流速度越快，探针的回收率会越低，这是由于微透析取样是在非平衡状态下进行的，灌流速度越快，半透膜两侧物质达平衡时间越短，回收率也就越低。降低流速，探针的回收率也会增大，但此时样品量也会随之减小，需要和一些灵敏度较高的检测手段配合使用，因此要综合考虑，确定适宜的灌流速度。本次实验采用正透析法和反透析考察了体外回收率，采用反透析法考察了体内回收率，结果表明在1～3 μL·min-1的流速范围内正透析法和反透析法所测得体内外回收率均随着流速的增大而减小，且正透析法和反透析法所测得体外回收率基本保持相似，体外回收率高于体内回收率，分析其原因有可能是探針植入过程中对探针半透膜造成的磨损，且动物处于清醒转态，活动期间也会造成血液微透析的磨损。其次也有可能是探针植入体内后，探针半透膜处于一个内环境中，膜外的细胞外液有蛋白类的大分子物质，有可能会吸附在半透膜上，造成体内回收率低于体外回收率。在此过程中血液探针回收率始终大于脑探针回收率，这是由于半透膜本身材质问题，血液探针半透膜长10 mm而脑探针的半透膜长2 mm，因此血液探针回收率始终大于脑探针回收率。

由于机体内药物浓度是一个动态变化的过程，因此研究恒定流速下，不同药物浓度对血、脑微透析探针的一致性，可得知透析液中药物浓度是否能准确反映待测部位的实际浓度。本实验以恒定流速2 μL·min-1，考察不同浓度3.125，6.25，12.5和25 μg·mL-1的天麻成分C对血、脑探针回收率的影响。结果表明不同质量浓度的天麻成分C所测得的探针回收率基本保持相似，其波动较小，说明在3.125～25 μg·mL-1的浓度范围内，天麻成分C的质量浓度对探针回收率无影响。有研究表明探针回收率还会随着温度的增加而增加。因此为了保持体内外环境的一致性，在研究体外探针回收率的过程中始终保持在37℃的环境下，以保证回收率的准确性。

参考文献：

[1]李云，王志伟，刘大会，等.天麻化学成分研究进展[J].山东科学，2016，29（4）：24-29.

[2]李燕，谢淼，邵明莎，等.近10年来天麻的药理作用及化学成分研究进展%[J].中华中医药学刊，2017，35（12）：2987-2993.

[3]段小花，李国花，吴霜，等.天麻乙酸乙酯提取物对大脑中动脉栓塞模型大鼠神经突触可塑性的影响[J].中国实验方剂学杂志.2013，19（1）：167-171.

[4]淤泽溥，林青，李秀芳，等.天麻醋酸乙酯提取物抗 ADP 诱导的家兔血小板聚集作用及机制[J].中草药，2007，38（5）：743-745.

[5]郭营营，林青，李秀芳，等.天麻酚性成分抗花生四烯酸诱导的家兔体外血小板聚集活性研究云[J].南中医学院学报，2012，35（5）：1-3.

[6]段小花，李秀芳，周宁娜，等.天麻提取物对血管性痴呆大鼠学习记忆及海马氧化损伤的作用[J].中成药，2011，33（7）：1138-1140.

[7]段小花，代蓉，李秀芳，等.天麻酚类成分对脑缺血大鼠海马一氧化氮和一氧化氮合酶的影响[J].中华老年心脑血管杂志，2011，13（7）：653-656.

[8]李秀芳，孙衍鲲，张维明，等.云南昭通天麻松弛血管平滑肌活性成分的筛选[J].中国实验方剂学杂志，2011，17（6）：159-162.

[9]李秀芳，孙衍鲲，张维明，等.天麻酯溶性酚性成分对大鼠脑缺血/再灌注损伤的保护作用[J].天然产物研究与开发，2011，23（5）：842-846.

[10]何晓山，张志朋，山培理，等.天麻成分 C 小鼠灌胃的急性毒性与催眠作用[J].新乡医学院学报，2011，28（5）：551-553.

[11]Young B，Kalanuria A，Kumar M，et al.Cerebral Microdialysis[J].Crit Care Nurs Clin North Am，2016，28（1）：109-124.

[12]宋宇尘，韩新民，袁海霞，等.脑微透析技术在神经精神疾病中的研究进展[J].医学研究生学报，2018，31（7）：750-755.

[13]刘健，吴嘉敏，方平飞.微透析技术在肿瘤药物研究中的应用进展[J].中国医院药学杂志，2018，38（7）：792-795.

[14]Holmgaard R，Nielsen J B，Benfeldt E.Microdialysis sampling for investigations of bioavailability and bioequivalence of topically administered drugs：current state and future perspectives.[J].Skin Pharmacol Physiol，2010，23（5）：225-243.

[15]王圣鑫，闫向丽，郑昊圳，等.微透析技术结合液质联用的不同剂量黄芪的补阳还五汤在脑缺血损伤大鼠脑药动学研究（英文）[J/OL].J Chin Phar Sci，2020，29（2）：90-101.

[16]Stenken J A，Lunte C E，Southard M Z，Sthle L.Factors that influence microdialysis recovery.Comparison of experimental and theoretical microdialysis recoveries in rat liver.[J].J Pharm Sci，1997，86（8）：958-66.

[17]陳腾飞，刘建勋，林力，等.栀子苷脑血微透析探针大鼠体内外试验回收率研究[J].药物分析杂志，2018，38（3）：425-431.

[18]王华富，桂志红，张小如，等.微透析法研究六味地黄丸在肾阴虚糖尿病大鼠模型的药动学[J].西北药学杂志，2019，34（1）：87-90.

[19]杜清，罗晶，管咏梅，等.基于微透析技术的雷公藤白芍微乳凝胶皮肤和血液药物动力学研究[J].中国中药杂志，2019，44（16）：3569-3575.

[20]Chen Teng-Fei，Liu Jian-Xun，Zhang Ying，et al.Analysis on microdialysis probe recovery of baicalin in vitro and in vivo based on LC-MS/MS[J].China J.Chin.Mater.Med.，2017，42（11）：2168-2174.

[21]Tang Hong-Yan，Chen Xiao-Lan，Wu Yu-Mei，et al.In vitro recovery rate of bullatine A microdialysis probe[J].China J.Chin.Mater.Med，2016，41（13）：2538-2542.