嗜酸乳杆菌增殖培养及冷冻干燥条件的优化

姜彩霞 ，姜秀杰 ，李晶 ，郑喜群

（1.黑龙江八一农垦大学国家杂粮工程技术研究中心，大庆 163319；2.黑龙江八一农垦大学食品学院）

乳酸菌是一类能利用可发酵糖产生乳酸的细菌的通称。乳酸菌自身在代谢过程中能够产生多种抑菌物质，这些物质在细菌体内的核糖体中合成具有抑菌活性的多肽类物质，能够对多种细菌产生抑制作用[1]。同时，乳酸菌也被认为是人体肠道中的重要微生物之一，与人体的健康息息相关[2-4]。嗜酸乳杆菌是乳酸菌家族中的重要成员[5-6]，具有维持肠道的微生态平衡，降低肠道内的pH值，预防和抑制病原菌及肿瘤的发生等功能特性，还可以增强机体免疫力、促进消化[7-10]。国内外很多知名的乳品公司都将嗜酸乳杆菌菌粉添加到婴幼儿配方奶粉中，用于调节婴儿胃肠道菌群平衡，同时对儿童部分情况引起的腹泻也具有一定的临床效果[11-12]。

近年来，随着人们健康意识的逐步增强，益生菌类食品在世界功能性食品中所占的份额逐渐增大[13-15]，其中，乳酸菌在国内外食品行业都已得到了广泛的应用，且年产量呈上升趋势[13-15]，但目前市场上同类产品活菌数量参差不齐，国内很多厂家使用的菌种都是国外企业的专利菌株，试验则从一株嗜酸乳杆菌的普通菌株出发，为我国益生菌行业的发展提供新思路。同时，大量研究结果表明，培养基的组分和配比以及培养条件对嗜酸乳杆菌的增殖和生长影响十分显著[16-17]。试验通过单因素试验优化了嗜酸乳杆菌增殖培养条件，力求活菌含量高，培养过程操作简单、成本低。另一方面，采用真空冷冻干燥方法制备冻干菌粉的过程中，由于低温环境对菌体的活性会产生一定的影响，因此需要添加一定量的低温保护剂减少活菌数的降低[18-20]。通过将主要的增殖培养条件和低温保护剂利用正交试验进行综合优化，旨在得到适合工业化生产的工艺参数，为我国嗜酸乳杆菌类益生菌食品的工业化生产奠定基础。同时也为我国益生菌类食品生产厂家以降低生产成本、增强产品的市场竞争力为目的进行自主研发和生产提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 菌种、材料与培养基

1.1.1 菌种和试剂

嗜酸乳杆菌冻干菌种（中国微生物菌种查询网）；试验用试剂和化学药品均为常规国产产品。

1.1.2 培养基

MRS液体培养基：酪蛋白胨1.0%，牛肉膏1.0%，酵母膏0.5%，葡萄糖2.0%，乙酸钠0.5%，柠檬酸二胺0.2%，吐温80 0.1%，磷酸氢二钾0.2%，七水硫酸镁 0.02%，七水硫酸锰 0.005%，pH 6.2～6.4，121 ℃灭菌20 min。

MRS固体培养基：在液体培养基的基础上添加2.0%碳酸钙和2.0%琼脂粉，121℃灭菌20 min。

黄豆汁的制备：黄豆200 g，加500 mL水煮沸半小时后用纱布过滤，加水补至500 mL，pH自然，121℃灭菌20 min。

西红柿汁的制备：西红柿200 g，洗净、切碎，加500 mL水煮沸30 min后用纱布过滤，加水补至500 mL，pH自然，121℃灭菌20 min。

1.2 主要仪器

紫外分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司），高速冷冻离心机（美国beckman），真空冷冻干燥机（北京思达兴业仪器有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 嗜酸乳杆菌增殖培养条件的优化

以MRS液体培养基为嗜酸乳杆菌增殖培养基，选取不同的摇床转速，分别为0、50、100、150和200 r·min-1；接种量分别为 3%、5%、7%、9%和 11%；黄豆汁作为补充氮源添加量分别为1%、2%、3%、4%和5%；西红柿汁作为增殖因子其添加量分别为6%、8%、10%、12%和14%。在以上各条件下培养温度均为37℃，培养时间均为20～24 h，且均以发酵液的OD600作为指标进行分析。

1.3.2 低温保护剂对嗜酸乳杆菌冷冻干燥后活菌数的影响

嗜酸乳杆菌发酵液于4℃下5 000 r·min-1，离心10 min 获得菌泥，静止 30 min 后按照 1∶3（v/v）加入无菌水悬浮清洗2次，合并清洗液分别加入NaCl、脱脂乳粉、甘油和谷氨酸钠配制成不同浓度的保护剂，其中 NaCl浓度（m/v）分别为 0%、0.2%、0.4%、0.6%和0.7%；脱脂乳粉浓度（m/v）分别为0%、5%、10%、15%和20%；甘油浓度（m/v）分别为0%、1%、2%、3%和4%；谷氨酸钠浓度（m/v）分别为0%、1%、2%、3%和4%。

1.3.3 增殖培养条件与低温保护剂提高冷冻干燥后嗜酸乳杆菌活菌数的正交试验

将黄豆汁和西红柿汁按照3∶10（v/v）的比例混合，在MRS液体培养基的基础上加入发酵促进剂，在真空冷冻干燥前加入低温保护剂。因此试验设计L9（34）正交试验对促进剂用量、接种量、脱脂乳粉及甘油4个因素作为考察因素，以真空冷冻干燥后菌粉的活菌数（cfu·g-1）为考察指标加以优化。

1.4 测定方法

1.4.1 真空冻干菌种的活化培养

严格按照无菌操作进行安瓿管开封。首次活化干粉要全部用完，干粉用尽量少的MRS培养液溶解，接种到5 mL的MRS液体培养基中，放于恒温培养箱中静止培养，培养温度为37℃，培养20～24 h。使用1 mL无菌注射器吸取少量发酵菌悬液制作涂片，用甲苯胺兰染色，通过镜检确定无杂菌后，再分别以10%的接种量接入MRS液体培养基中活化2次，培养温度为37℃，培养时间均为20～24 h。

1.4.2 活菌数和发酵液OD600值的测定

活菌数的测定：采用涂布平板计数法测定活菌数[6]。

发酵液OD600值的测定：在600 nm波长处测定发酵液的OD600值，以灭菌后未接种的培养基为空白调零。

1.4.3 嗜酸乳杆菌生长曲线的测定

5%接种量，37℃培养，每2 h取样一次分别测定发酵液的OD600值和活菌数，并绘制嗜酸乳杆菌的生长曲线。

1.4.4 嗜酸乳杆菌冻干菌粉的制备

加入低温保护剂的液体盛放在塑料盒中，厚度不超过2 cm，于普通冰箱中放置12 h后转移至低温冰箱中-30℃预冻2 h，最后进行进行真空冷冻干燥，其参数为-80℃，真空度＜10 pa，冷冻干燥24 h得干燥菌粉。

2 结果与分析

2.1 通过对嗜酸乳杆菌典型生长曲线的测定确定最佳收获期

在嗜酸乳杆菌进行增殖培养之前测定该菌种在MRS液体培养基中的生长曲线是十分必要的，只有准确地掌握了嗜酸乳杆菌的生长曲线才能确定最佳的接种时间，进而增殖培养。嗜酸乳杆菌的生长曲线分别见图1。

图1 嗜酸乳杆菌的生长曲线及培养液活菌数Fig.1 OD600 value and number of live bacteria in Lactobacillus acidophilus culture medium

从图1可以看出：随着培养时间的不断延长培养液的OD600值和活菌数均呈现上升趋势，培养4 h后嗜酸乳杆菌进入对数生长期，培养20 h后进入稳定期，此时培养液的活菌数也处于较高的水平，为2.01×1010cfu·mL-1，随着培养时间的继续延长，培养液的OD600值基本保持不变，活菌数呈现略下降的趋势，因此试验嗜酸乳杆菌增殖培养的最佳收获期为20 h，另一方面，培养液的OD600值和活菌数两者呈现出一定的正相关特性，为简化试验过程，试验以下各优化条件均以培养液的OD600值为指标进行分析。

2.2 嗜酸乳杆菌增殖培养条件的优化

2.2.1 摇床转数的选择

一般液体培养均采用摇床培养，摇床转速便成为了影响菌体生长发育以及生化代谢的重要工艺参数之一，因此试验通过比较不同转速下培养液的OD600值确定最佳的摇床转速，其结果如图2。

图2 摇床转速对培养液OD值的影响Fig.2 Effect of shaker rotation speed on OD value of culture medium

从图2中可以看出，当摇床转速逐渐增大时培养液的OD600值呈下降趋势，当摇床转速大于100 r·min-1时培养液的OD600值下降较明显，其主要原因可能是嗜酸乳杆菌为耐氧菌，当转速较低时对其增殖培养影响不大，但当转速略大时增加的溶解氧会影响其繁殖，因此试验采用静止培养。

2.2.2 接种量的测定

培养菌体时适当的接种量是十分必要的，因为它能够直接影响菌体繁殖的状态及周期，不同接种量下培养液的OD600值见图3。

图3 接种量对培养液OD600值的影响Fig.3 Effect of inoculum size on OD600 value of culture medium

从图3得出：当接种量为3%时培养液中初始菌种含量较低，因此发酵液的OD600值较低。当接种量为5%时培养液的OD600值最高，随着接种量的继续增大，培养液的OD600值逐渐降低，因此试验确定的最佳的接种量为5%。

2.2.3添加黄豆汁对嗜酸乳杆菌增殖培养的影响

众所周知，碳源和氮源是培养基的重要组成部分，对微生物的生长具有十分显著的影响，大量文献均表明葡萄糖是嗜酸乳杆菌繁殖和生长的良好碳源，因此试验直接采用葡萄糖作为嗜酸乳杆菌增殖培养的碳源[16]。另一方面，经研究发现单一的氮源对菌体增殖培养的效果往往不如复合氮源好[16-17]，故试验在MRS液体培养基中添加了少量的黄豆汁作为补充氮源，其对培养液OD600值的影响见图4。

图4 添加黄豆汁对培养液OD600值的影响Fig.4 Effect of amount of soybean juice on the OD600 value of culture medium

图4 为添加黄豆汁作为补充氮源对培养液OD600值的影响。图4可见，随着黄豆汁添加量的逐渐增加，培养液的OD600值呈现出先增加后稳定的趋势，当黄豆汁的添加量为3%时培养液的OD600值达到最大，继续增加黄豆汁的添加量培养液的OD600值几乎不变，故选择黄豆汁的添加量为3%。

2.2.4 添加西红柿汁对嗜酸乳杆菌增殖培养的影响

天然提取物富含多种糖类、氨基酸、维生素等多种物质，是乳酸菌的常用增殖因子[21]，添加西红柿汁对培养液OD600值的影响见图5。

图5 添加西红柿汁对培养液OD600值的影响Fig.5 Effect of amount of tomato juice on OD600 value of culture medium

图5 可见，随着添加量的增加，培养液的OD600值呈现出先增加后略降低的趋势，当西红柿汁的添加量为10%时培养液的OD600值达到最大，故选择西红柿汁的添加量为10%。

2.3 低温保护剂对嗜酸乳杆菌冷冻干燥后活菌数的影响结果

2.3.1 NaCl浓度对嗜酸乳杆菌冷冻干燥后活菌数的影响

不同浓度的NaCl对嗜酸乳杆菌冷冻干燥后活菌数的影响见图6。

图6 NaCl浓度对嗜酸乳杆菌冷冻干燥后活菌数的影响Fig.6 The effect of NaCl on freeze drying of Lactobacillus acidophilus

由图6可知，添加NaCl后嗜酸乳杆菌冷冻干燥后活菌数较未添加NaCl活菌数高，说明NaCl溶液能够提高嗜酸乳杆菌的抗冻性，其可能的原因是NaCl改变了菌泥的渗透压，进而改变了嗜酸乳杆菌细胞膜的通透性。当NaCl浓度小于0.2%时，嗜酸乳杆菌冷冻干燥后活菌数呈上升趋势，但NaCl浓度大于0.2%时，活菌数逐渐降低，故最佳的NaCl浓度为0.2%。

2.3.2 脱脂乳粉浓度对嗜酸乳杆菌冷冻干燥后活菌数的影响

不同浓度的脱脂乳粉对嗜酸乳杆菌冷冻干燥后活菌数的影响见图7。

图7 脱脂乳粉浓度对嗜酸乳杆菌冷冻干燥后活菌数的影响Fig.7 The effect of skim milk powder on freeze drying of Lactobacillus acidophilus

由图7可知，当脱脂乳粉浓度小于10%时，嗜酸乳杆菌冷冻干燥后活菌数呈上升趋势，但脱脂乳粉浓度大于10%时，活菌数逐渐降低，故最佳的脱脂乳粉浓度为10%。脱脂乳粉对嗜酸乳杆菌冷冻干燥后活菌数的提高作用，可能是脱脂乳粉在菌体外能够形成蛋白膜，加强了对菌体的保护作用。

2.3.3 甘油浓度对嗜酸乳杆菌冷冻干燥后活菌数的影响

甘油作为一类应用较为普遍的冻干保护剂能够有效维持生物大分子活性物质的原有结构。不同浓度的甘油对嗜酸乳杆菌冷冻干燥后活菌数的影响见图8。

图8 甘油浓度对嗜酸乳杆菌冷冻干燥后活菌数的影响Fig.8 The effect of glycerin on freeze drying of Lactobacillus acidophilus

由图8可知，当甘油浓度小于2%时，嗜酸乳杆菌冷冻干燥后活菌数呈上升趋势，但甘油浓度大于2%时，活菌数逐渐降低，故最佳的甘油加入浓度为2%。

2.3.4 谷氨酸钠浓度对嗜酸乳杆菌冷冻干燥后活菌数的影响

不同浓度的谷氨酸钠对嗜酸乳杆菌冷冻干燥后活菌数的影响见图9。

图9 谷氨酸钠浓度对嗜酸乳杆菌冷冻干燥后活菌数的影响Fig.9 The effect of glycerin on freeze drying of Lactobacillus acidophilus

由图9可知，当谷氨酸钠浓度小于2%时，嗜酸乳杆菌冷冻干燥后活菌数呈上升趋势，但谷氨酸钠浓度大于2%时，活菌数逐渐降低，故最佳的谷氨酸钠加入浓度为2%。

2.4 增殖培养条件与低温保护剂提高冷冻干燥后嗜酸乳杆菌活菌数的正交试验结果

发酵和冷冻干燥都是提高嗜酸乳杆菌菌粉活菌数的非常重要的阶段，为简化工艺参数，探索出适合工业化生产和监控的工艺流程，将嗜酸乳杆菌的增殖培养和冷冻干燥作为一个整体进行考量，对活菌数影响较大的因素进行综合优化。结果见表1。

表1 正交试验结果及极差分析Table 1 Orthogonal test results and range analysis

由表1正交试验结果表明：接种量和脱脂乳粉的添加量对嗜酸乳杆菌增殖培养及冷冻干燥过程中活菌影响效果较明显，影响顺序依次为接种量＞脱脂乳粉＞促进剂用量＞甘油。最优的低温保护剂组合为A1B2C2D2，即促进剂用量12%，接种量5%，脱脂乳粉10%，甘油2.0%，在此条件下嗜酸乳杆菌冻干菌粉的活菌数最高，达到了 8.9×1011cfu·g-1。

3 结论

嗜酸乳杆菌增殖培养条件经单因素优化试验表明最优的条件为：5%接种量，黄豆汁添加量为3%，西红柿汁添加量为10%，静止培养20 h，其活菌数达到1.84×1011cfu·g-1，接种量的大小对嗜酸乳杆菌增殖数量影响程度较其他因素大。黄豆汁、西红柿汁分别作为主要氮源和主要生长因子补充剂对嗜酸乳杆菌的增殖具有一定的促进作用，根据单因素试验结果确定黄豆汁：西红柿汁比例为3∶10。

嗜酸乳杆菌冷冻干燥保护剂的单因素试验结果表明，添加一定量的NaCl、脱脂乳粉、甘油、谷氨酸钠对嗜酸乳杆菌冷冻干燥过程中菌体存活率都具有一定程度的提高，其中添加10%脱脂乳粉和2.0%甘油较其他因素条件下嗜酸乳杆菌冻干菌粉的活菌数更高。

进一步进行嗜酸乳杆菌增殖培养接种量和黄豆汁：西红柿汁加入量及冷冻干燥保护剂对活菌数影响的正交试验结果表明，试验因素对活菌数影响顺序依次为接种量＞脱脂乳粉＞促进剂用量＞甘油。最优的增殖培养条件和低温保护剂组合为：促进剂用量12%，接种量5%，脱脂乳粉10%，甘油2.0%，在此条件下嗜酸乳杆菌冻干菌粉的活菌数可达到8.9×1011cfu·g-1。