HLA-DRB1等位基因与广东汉族人群甲真菌病的相关性研究

蓝雨， 郑博文， 鲁莎， 李希清， 张军民

(中山大学孙逸仙纪念医院皮肤科，广东 广州 510120)

甲真菌病是由皮肤癣菌、酵母菌及非皮肤癣菌等真菌侵犯甲板或甲下所引起的疾病，是皮肤癣菌病中最顽固难治的一种。暴露于相同环境的个体对甲真菌病的敏感性提高,说明可能有甲真菌病的遗传易感基因的存在，遗传成分可能会改变个体对真菌感染的敏感性，并且可能影响甲真菌病患者后续的治疗。既往研究表明,甲真菌病的易感性与人类白细胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)相关[1]，HLA基因编码主要组织相容性复合物(major histocompatibility complex,MHC)用于呈递加工后的病原体抗原，并且和免疫应答密切相关[2]，而免疫反应的异常可能会导致甲真菌病的遗传易感性。其中HLA-DR/DQ亚区在结构上变化最大，因而显示出明显的疾病关联性[3]。本研究对广东汉族人群甲真菌病患者HLA-DRB1等位基因进行检测与分析，初步探讨HLA-DRB1基因多态性与甲真菌病的遗传关联性。

1 对象与方法

1.1 研究对象

纳入64例来自2019年4月—12月在本院皮肤科门诊经直接镜检和(或)真菌培养确诊为甲真菌病者，年龄16～82岁,彼此间无亲缘关系。排除患严重的心、肺、脑、肝、肾等基础疾病者、患糖尿病者以及正在服用免疫抑制剂或激素者。同时招募64例本院就诊的健康志愿者，其性别、年龄均与患者组相匹配，不伴有其他疾患，既往无甲病病史，否认个人不良嗜好。两组受试个体间无血缘关系，且均为广东汉族人群。研究经本院伦理委员会批准(批件号:2019-KY-039)。所有入组者均签署知情同意书。

1.2 研究方法

1.2.1 全血基因组DNA的提取 抽取样本外周静脉血3 mL，置于EDTA抗凝管4 ℃下保存，采用血液基因组DNA提取试剂盒(北京天根生物技术有限公司)，严格按照说明书要求提取样本DNA。应用N60 Touch超微量分光光度计(德国IMPLEN公司)检测,并调整至DNA浓度>10 ng/μL，OD260/OD280比值1.7～1.9，置于-20 ℃冰箱保存。

1.2.2 HLA-DRB基因等位分型 采用聚合酶链式反应-序列特异性引物(PCR-SSP)法对128份样本的DNA进行HLA-DRB等位基因分型。按文献[4]合成序列特异性引物(共14条5′-引物，18条3′-引物，组成23对引物)及内对照引物(扩增HLA-DRB1基因第3内含子796 bp片段的保守序列)，所有引物均由上海生工公司合成。加用Taq 聚合酶(日本Takara公司)及DNA样本后进行PCR扩增(C1000 Touch PCR仪器，美国BIO-RAD公司)，扩增后的产物直接置于DYY-6C型电泳仪(北京市六一仪器厂)进行2%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像(天能1220凝胶成像系统)后观察结果。

1.3 统计学处理

采用直接计数法进行HLA-DRB1等位基因频率的计算，等位基因频率=某基因位点阳性数/(2×样本数)。数据采用SPSS 24.0软件进行统计处理。采用2检验比较组间HLA-DRB1等位基因频率，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料

64例甲真菌病患者中，80%以上为脑力工作者，否认工作及生活环境欠佳导致发生甲真菌病。其中男30例，女34例；年龄16～82岁，平均(45.39±16.54)岁；指甲感染10例(15.62%)，趾甲感染47例(73.44%)，指趾甲感染7例(10.94%)；病程1月～20年，平均(4.57±4.67)年；真菌培养阳性22例，其中红色毛癣菌10例，须癣毛癣菌6例，念珠菌和镰刀菌各3例；临床表现为远端侧位甲下型36例(56.25%)，白色浅表型17例(26.56%)，近端侧位甲下型8例(12.50%)，全甲毁损型3例(4.69%)；家属有感染者13例(20.31%)，其中父母或子女感染9例(14.06%)，夫妻感染4例(6.25%)。

健康对照组共64例，其中男32例，女32例；年龄20～75岁，平均(42.44±15.16)岁。甲真菌病组与对照组间、红色毛癣菌感染的甲真菌病患者组与对照组间相比，性别(2值分别为0.13、0.35)及平均年龄间(t值分别为1.05、1.08)均无明显差异(P值均>0.05)。

2.2 甲真菌病患者和健康对照组HLA-DRB等位基因频率的比较

甲真菌病患者和健康对照组HLA-DRB1位点分布分别检测出13和12个等位基因，呈现较高的基因多态性。其中甲真菌病患者共5例DRB1*10基因阳性，健康对照组未检出DRB1*10等位基因，两组差异有统计学意义(2=5.10，P<0.05)。详见表1。

2.3 红色毛癣菌感染的甲真菌病患者与健康对照组HLA-DRB等位基因频率的比较

红色毛癣菌感染的甲真菌病患者和健康对照组HLA-DRB位点分布分别检测出8和12个等位基因。红色毛癣菌感染组未检出DRB1*01、04、07、12、16等位基因。健康对照组25例DRB1*12基因阳性，无DRB1*10等位基因阳性。红色毛癣菌感染组DRB1*12基因频率明显低于健康对照组(2=4.70，P<0.05)，而DRB1*10基因频率则高于健康对照组(2=6.44，P<0.05)，进一步证明HLA-DRB1*10可能是其易感基因之一。详见表2。

表1 两组HLA-DRB1等位基因频率的比较Tab.1 Comparison of HLA-DRB1 allele frequencies between the two groups

表2 红色毛癣菌感染的甲真菌病患者和健康对照组HLA-DRB1等位基因频率的比较Tab.2 Comparison of HLA-DRB1 allele frequencies between onychomycosis caused by Trichophyton rubrum and the controls

3 讨论

甲真菌病是甲病中最常见的一种类型，主要由以红色毛癣菌为首的皮肤癣菌感染引起。生活方式、基础疾病以及遗传基因等各种因素都影响其患病率。由于甲板的构造特殊，抗真菌药无法准确作用于病灶而起作用，导致甲真菌病治疗困难，易于形成一个潜在的传染源，被认为是一种真菌传染性疾病，因此关于基因易感性的遗传学研究较少。Zaias等[5]对12例来自不同国家先证者的家族谱系进行研究，发现与甲癣患者结婚长达18～60年的伴侣没有一个人被感染，反而所有感染甲癣的子女，其父母至少有一方也是甲癣患者，提示了甲真菌病的常染色体显性遗传模式。

HLA是目前已知最具有多态性和最复杂的遗传标记，与免疫系统疾病、肿瘤、过敏反应、微生物感染等疾病相关[6]。个人对感染产生的免疫反应很大程度上取决于HLA分子将抗原呈递给T细胞和其消除感染细胞的能力。HLA基因已被证明与麻风杆菌[8]和HPV[9]的慢性持续感染有密切关系，不仅危害患者的组织器官，还影响患者的心理健康。除细菌和病毒感染外，既往报道HLA与球癣菌病(HLA-A9、-B13、-B40)、球孢子菌病(HLA-DRB1*1301)、隐球菌病(HLA-B*5601)、组织胞浆菌病(HLA-B22和-B17)和着色芽生菌病(HLA-A29)均相关[7]，说明感染性疾病可能通过共同的免疫途径起作用。因此对于临床常见的甲真菌病来说，遗传学研究对于疾病的预防和探索新的治疗方法具有重要的意义。

Zaitz等[10]研究认为，HLA-DR53(HLA-DRB4)可能是巴西北欧犹太人红色毛癣菌导致的甲癣的拮抗基因，而DR52(HLA-DRB3)可能是其易感基因。在墨西哥地区的临床研究中发现HLA-DR6(HLA-DRB1*06)可能是混血墨西哥人红色毛癣菌感染的甲癣的拮抗基因[7]，而HLA-DR8(HLA-DRB1*08)是其易感基因[11]。我国目前仅有一篇文献指出HLA-DRB1*14可能系苏皖籍汉族人群甲须癣毛癣菌感染的易感基因，而HLA-DRB1*15可能是其拮抗基因[12]，暂时无广东汉族人群的相关研究。本研究对广东汉族人群的甲真菌病相关基因进行初步探讨，发现甲真菌病患者组和红色毛癣菌导致的甲癣患者组HLA-DRB1*10基因频率高于健康对照组，因此HLA-DRB1*10可能是其易感基因。而红色毛癣菌导致的甲癣患者HLA-DRB1*12基因频率低于健康对照组，HLA-DRB1*12基因可能为红色毛癣菌导致的甲癣的保护性基因，该基因的存在可使个体免于感染红色毛癣菌导致的甲癣。该结果进一步证实了HLA等位基因在真菌感染中的地位。但以上各项研究结果间有差异，原因可能为研究样本来源于不同地域和种族的人群，以及样本量的不同、试验方法的差异，导致结果产生偏移。因此在未来的研究中需要扩大样本量以及增加样本来源，综合各个地区、民族甲真菌病患者的相关基因分析，才能更加准确地反映出HLA-DRB等位基因与甲真菌病的相关性。

鉴于甲真菌病的顽固难治性和高复发率，有效的预防措施显得十分重要，首先要积极纠正整体易感因素[13]。尽早筛选出甲真菌病的易感基因，能够使遗传易感者提前有效地避免环境和生活方式等因素的影响，也可以在患病的情况下适当延长用药时间，或治愈后定期涂抹抗真菌擦剂，以便更有效的防治。在甲真菌病患者长期口服肝毒性抗真菌药物的情况下，疗效的差异也可能是由于基因相关的药物遗传变异所导致。因此易感基因的鉴定对于药物遗传学也具有重要意义。通过识别易感基因位点并进行相关功能研究，可为高危个体的筛查、出现症状前患者的早期诊断提供有效手段。

综上所述，本研究初步探讨了广东汉族人群HLA-DRB1等位基因与甲真菌病的相关性，结果显示HLA-DRB1*10可能是其易感基因，而HLA-DRB1*12基因可能是红色毛癣菌导致的甲癣的保护性基因。本研究不仅有助于甲真菌病发病机制的研究，而且对该病早期诊断和治疗都有一定的帮助。