饲料原料基质中不同营养成分对黄曲霉毒素B1合成关键基因表达影响的研究

■刘 婕 余保宁 李 理 张妮娅 齐德生*

（1.华南理工大学食品科学与工程学院，广东广州510641；2.广东燕塘乳业股份有限公司，广东广州511356；3.华中农业大学动物科技学院，湖北武汉430070）

据世界粮农组织估计，目前世界范围内至少有25%的农作物受到了真菌毒素的污染[1]，其中黄曲霉毒素（Aflatoxin，AF）的污染最严重。不同的饲料原料被黄曲霉毒素污染的程度会有差别，如同为能量饲料的玉米和小麦，玉米更容易被AF污染；且同为蛋白质饲料的豆粕和花生粕，花生粕更易被AF污染[2]。近年来研究发现，在油料种子中AF 的污染要更严重[2]，Mellon 等[3]发现，在玉米胚中A. flavus产生AFB1的量远远高于玉米胚乳中的产毒量。且本课题组前期研究发现，除了油脂含量能显著影响AFB1合成以外，饲料原料基质成分的差异也会造成AF污染水平的不同[2，4]。天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、水苏糖和锌能够明显地刺激AFB1产生，而铜、铁和锰不利于黄曲霉产生AFB1。随着可溶性糖、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸和丙氨酸添加量增加，均能明显促进黄曲霉菌丝生长（P＜0.05）；而锌、铁和锰均能促进黄曲霉菌丝生长，但是铜明显抑制黄曲霉菌丝生长（P＜0.05）[4]。目前的研究基本阐明了不同的饲料原料被AF污染存在差异性主要是由饲料中的营养成分的种类和含量所决定的，但这些营养成分的调控机制是什么，还需要进一步研究。因此本研究在课题组前期试验结果的基础上，选取对A. flavus产毒和生长影响较大的营养成分及水平，研究其对AF 生物合成过程中的关键基因（aflP、aflS、aflD、aflM和aflP）的表达情况的影响。从而揭示饲料中不同营养成分对A. flavus产毒影响的作用机制。本研究结果将对指导饲料生产以及控制饲料AFB1污染提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

黄曲霉产毒菌株（Aspergillus flavusNRRL-3357）由中山大学贺竹梅教授实验室赠送。马铃薯葡萄糖琼脂培养基（Potato Detrose Agar，PDA）（青岛海博生物技术有限公司）。DNA Marker（大连宝生物）、琼脂糖（Biowest，法国）、TRizol 试剂（Invitrogin，美国）、反转录试剂盒（Takara，日本）、RNase Inhibitor（Vazyme Biotech，美国）、Premix Taq（Takara，日本）、iTaq Universal SYBR Green Super mix（Bio-Rad，美国）。本试验用到的所有化学试剂无特殊说明均为分析纯。

试验所用的基础培养基为察氏培养基：0.3%NaNO3、0.1% K2HPO4、0.05% MgSO4·7H2O、0.05% KCl、0.001% FeSO4·7H2O和3.0% 蔗糖。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株保存活化及孢子悬浮液的制备

将A. flavusNRRL-3357菌株保存在20%甘油中，然后保藏于-80 ℃冰箱中用于后续研究。待用时，将保存的菌株在PDA培养基活化培养，于恒温培养箱中30 ℃培养7 d。然后在培养皿中加入约20 ml孢子洗涤液（含有0.05% 吐温-80的无菌生理盐水）[5]，用无菌棉棒轻轻洗下黄曲霉孢子，然后将含有孢子的洗涤液经过4层无菌纱布过滤，收集滤液于含有玻璃珠的无菌蓝盖试剂瓶中，振荡摇匀，让孢子均匀分布在孢子洗涤液中。吸取适量的孢子液小心置于血球计数板（25×16）的计数室内，盖上盖玻片，静置片刻，在显微镜下计数。然后将孢子液稀释到需要的浓度备用[6]。

1.2.2 菌丝体的收集

参考前期研究的结果[4]及国内外研究数据，选择可溶性糖：蔗糖、葡萄糖、麦芽糖和水苏糖；氨基酸：天冬氨酸、谷氨酸和精氨酸；微量元素：锌（七水硫酸锌ZnSO4·7H2O）和铜（五水硫酸铜CuSO4·5H2O）作为试验材料。可溶性糖的添加量为1.0、3.0 g/100 ml；氨基酸的添加量为0.5 g/100 ml；微量元素的添加量为50 mg/l。用6.0 mol/l的盐酸和5.0 mol/l的NaOH将每组培养基的pH 值调至6.0。然后将培养基分装到100 ml 三角瓶中，每个三角瓶中培养基的体积为30 ml。用透气封口膜封口后121 ℃高温高压灭菌20 min，待冷却至室温后，接种100 μl 黄曲霉孢子菌悬液（1×108个/ml）混匀，将三角瓶用透气封口膜封口之后置于气浴摇床中培养3 d 和5 d，培养温度为30 ℃，摇床转速为150 r/min。培养结束后将三角瓶中的培养基和菌丝体通过滤纸过滤，收集菌丝体，菌丝体保存于-80 ℃用于基因表达量的测定。每组5个重复。

1.2.3 AFB1合成相关基因表达量测定

总RNA 的 提 取 采 用TRIzol Reagent（InvitrogenTM, USA），并参考曾丽梅[7]的方法。RNA 反转录使用的是Takara PrimeScript反转录试剂盒，反转录反应条件：37 ℃15 min；85 ℃5 s；结束后保持4 ℃。

1.2.4 Real-time PCR基因表达量的检测

1.2.4.1 引物设计

利用Primer 5.0引物分析软件分别设计此次试验所用的特异性上下游引物，beta-tubulin基因作为内参基因。引物由武汉擎科创新生物科技有限公司合成。将冻干粉状态的引物用超纯水配置成10 μmol/l的工作溶液，-20 ℃保存。各引物序列如表1所示。

1.2.4.2 cDNA质量检测

将提取的总RNA 进行反转录后，通过PCR 扩增检测反转录得到的cDNA 的质量。并对设计的引物用cDNA进行PCR扩增，1.0%琼脂糖凝胶电泳检测扩增的产物。

表1 试验所涉及的引物

PCR 反应程序：98 ℃，5 min；98 ℃，10 s；55 ℃，30 s；72 ℃，45 s；72 ℃，10 min；40 个循环，反应结束后保持在4 ℃。

1.2.4.3 Real-time PCR

确定了模板cDNA 和各对引物的质量后，Realtime PCR 试验使用BIO-RAD 公司的iTaq Universal SYBR Green Supermix，在BIO-RAD CFX 系列Realtime PCR检测系统上完成。

反应程序：95 ℃，4 min；95 ℃，10 s；57 ℃，10 s；72 ℃，20 s；40 个循环。熔解曲线条件：55 ℃升温至93.5 ℃，每0.5 ℃读5 s。

1.3 数据处理

图1 可溶性糖对AFB1合成关键基因表达量的影响（5 d）

本试验的数据经Excel处理之后，结果按照“平均值±标准差（SD）”的方式表示。然后利用SPASS 22.0（Chicago，USA）软件进行统计分析，采用单因素方差分析。使用Duncan′s 检验对各处理组间平均值进行多重比较，P＜0.05为差异显著。基因的相对表达量用2-△△Ct方法进行计算。

2 结果

本试验研究了不同的营养成分对AF合成过程中相关基因表达的影响。试验选择了5个关键基因，分别是AF 合成过程中最关键的两个调节基因aflP和aflS，以及3 个结构基因aflD、aflM和aflP，这3 个结构基因分别代表了AF合成的前、中、后期3个阶段。

2.1 可溶性糖对AF合成中关键基因表达的影响（见图1）

根据前期试验结果，由于果糖和棉子糖对AFB1 合成的促进作用不如其它4 种可溶性糖明显，所以选择了蔗糖、葡萄糖、麦芽糖和水苏糖作用试验材料，而且1.0%和3.0%的可溶性糖对黄曲霉产毒的影响差异很明显，所以本试验选择1.0%和3.0%两个浓度。在培养5 d 时，4 种可溶性糖对AF合成相关基因的表达的影响见图1。相比于1.0%的蔗糖、葡萄糖、麦芽糖和水苏糖，当这4 种可溶性糖的含量增加到3.0%时，能明显促进基因aflS、aflD、aflM和aflP的表达，同时3.0%葡萄糖（P＜0.01）和水苏糖（P＜0.001）也显著促进了aflP基因的表达。对于蔗糖、葡萄糖和麦芽糖，基因aflP表达量增加最为明显，增加了近百倍，而在水苏糖中基因aflS的表达量增加最为明显。

2.2 氨基酸对AF 合成中关键基因表达的影响（见图2～图3）

图2 天冬氨酸（A）、谷氨酸（B）、精氨酸（C）对AFB1合成关键基因表达量的影响（5 d）

图3 天冬氨酸（A）、谷氨酸（B）、精氨酸（C）对AFB1合成关键基因表达量的影响（3 d）

根据前期试验结果得知，由于丙氨酸和甘氨酸对AFB1 合成的促进作用不如天冬氨酸、谷氨酸和精氨酸明显，所以选择了0.5%天冬氨酸、谷氨酸和精氨酸进行研究。3 种氨基酸对AF 合成相关基因的表达见图2（培养5 d）。培养5 d时，天冬氨酸对AF合成中5个关键基因的表达有一定促进作用，但差异不显著；而在培养3d时，天冬氨酸可以明显促进这5个关键基因的表达，见图3A。培养5 d 时，谷氨酸明显提高了基因aflP、aflD和aflM的表达量（P＜0.05），同时对基因aflS和aflP的表达也有一定的促进作用，差异不显著；但在培养3 d 时，谷氨酸显著上调了基因aflP的表达（P＜0.01），见图3B。同样在培养5 d时，精氨酸可以显著提高调节基因aflP（P＜0.05）和aflS（P＜0.001）的表达量，但是同时也抑制了基因aflD、aflM和aflP的表达（P＜0.01），而在培养3 d 时精氨酸对基因aflD、aflM和aflP的表达有一定的促进作用见图3C。

2.3 铜和锌对AF 合成过程中关键基因表达的影响（见图4～图5）

图4 锌和铜对AFB1合成关键基因表达量的影响（5 d）

图5 锌和铜对AFB1合成关键基因表达量的影响（3 d）

根据课题组前期的试验结果，锌能够明显促进AFB1合成，铜不仅显著抑制了AFB1合成还抑制了黄曲霉菌丝生长，所以选择50 mg/l 的锌和铜作为研究对象。锌和铜对AF合成相关基因的表达见图4（培养5 d）。与对照组相比，锌明显抑制了基因aflS、aflD、aflM和aflP的表达，同时铜明显抑制aflP、aflS、aflD、aflM和aflP基因的表达。虽然在培养5 d 后，锌对AF合成关键基因的表达都是抑制状态，但是在培养3 d时，锌能够极显著地促进这5 个关键基因的表达（P＜0.001），尤其是基因aflP，表达量上调200 多倍，见图5A；铜依然显著抑制了基因aflP和aflS的表达见图5B。

3 讨论

AF生物合成的初始阶段类似于脂肪酸的生物合成，即乙酰CoA（Acetyl-CoA）作为其起始单位，而丙二酸单酰CoA作为延长单位，在聚酮化合物合成酶的催化作用下形成AF 的聚酮骨架[8-10]。AF 的生物合成调控是一个复杂的多个途径相互作用的过程，AF 合成通路基因成簇排列在70 kb的DNA序列上，其序列上包含了25个已定义明确的基因[11]。如基因aflP和aflS是AF 合成基因簇中相邻的两个调节基因，直接调控着AF 和ST（sterigmatocystin）的合成。aflD基因编码的酮还原酶，可以将NOR（norsolorinic acid）转化为AVN(averantin)[12]；aflM参 与DMST（demethyl-sterigmatocystin）的合成[13]；aflP参与ST 到OMST（O-methylsterigmatocystin）以及DMST 到DHOMST（dihydro-demethyl-sterigmatocystin）的转化过程[14]。基因aflD、aflM、aflP分别代表了AF 合成途径中的前中后段[15]。因此，本试验一共选取这5个关键基因作为代表来研究这些营养元素对AF合成相关基因表达的影响。

天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、水苏糖和锌能够明显地刺激AFB1产生，而铜不利于黄曲霉产生AFB1[4]。本试验选择了1.0%和3.0%的蔗糖、果糖、麦芽糖和水苏糖作为研究对象。结果表明，3.0%的可溶性糖都能明显促进aflS、aflD、aflM和aflP基因的表达，3.0%葡萄糖和水苏糖促进了aflP基因的表达，但是蔗糖和麦芽糖中aflP基因的表达却受到了抑制，可能是因为末端产物（AF）积累过多从而反馈阻遏了aflP基因的表达。本试验选择了0.5%的天冬氨酸、谷氨酸和精氨酸作用试验材料。培养5 d时，天冬氨酸对AF合成中5个关键基因的表达有一定的促进作用，但是差异不显著；谷氨酸明显提高基因aflP、aflD和aflM的表达量，但基因aflS和aflP差异不显著，精氨酸显著提高调节基因aflP和aflS的表达量，同时抑制了基因aflD、aflM和aflP的表达。但是在培养3 d时，AFB1在培养基中还没有大量积累，3种氨基酸均明显刺激了5 个关键基因（aflP、aflS、aflD、aflM、aflP）的表达。同样，这种现象也出现在了微量元素的试验中，培养5 d 时锌明显抑制了基因aflS、aflD、aflM和aflP的表达，但是在培养3 d时，锌极显著地促进了这5 个关键基因的表达。这个现象也进一步证实了AFB1 的积累会反馈阻遏AF 合成相关基因的表达，这种反馈阻遏首先是抑制结构基因的表达，然后再抑制调节基因的表达。铜不利于AFB1 的合成[4]，首先是抑制了两个调节基因aflP和aflS的表达，然后再抑制结构基因的表达。本试验结果表明，这些营养元素通过促进关键基因的表达，从而加强AFB1合成，其中对结构基因aflM和aflP影响尤为显著，同时调节基因aflP和aflS在AFB1合成过程中起关键作用。

4 结论

不同饲料原料中AFB1污染存在差异是由各种成分共同作用的结果，因此，通过调控原料中单一营养成分来控制饲料原料中AFB1的污染很难实现。可溶性糖、氨基酸和微量元素均可通过对AF 合成关键基因（aflP、aflS、aflD、aflM、aflP）不同程度的上调，从而促进AFB1 合成。所以可以寻求物理、化学或生物的方法，抑制AF 合成调节基因（aflP、aflS）的表达，从而控制黄曲霉毒素的污染。