基于网络的脑卒中血液代谢标志物分析

吴晓霞, 于心悦, 黄 寅, 刘佩芳

(1. 海南省海口市人民医院, 海南 海口, 570208; 2. 中国药科大学, 江苏 南京, 210009;3. 哈尔滨医科大学附属第二医院, 黑龙江 哈尔滨, 150086)

脑卒中又称中风，由大脑血管堵塞造成大脑缺血、缺氧或血管突然发生破裂出血而引起，临床分为缺血性脑卒中(IS)和出血性脑卒中(HS) 2大类。根据《中国心血管病报告2018》，中国脑卒中发病率持续升高，每年增加约8.3%; 病死率处于稳定状态，每年约为124/10万[1]。现有研究[2-3]表明，脑卒中通过氧化应激、神经炎症等多种途径造成中枢神经系统损伤，并引发认知障碍、胃肠出血等诸多后遗症和并发症。在此过程中，脑部及全身的代谢稳态失衡亦被证实发挥着重要作用。例如，一碳代谢途径中甲硫氨酸循环的变化会使得同型半胱氨酸水平升高，导致血管平滑肌细胞增殖、内皮功能障碍、脂质积聚等一列问题，从而易造成血管堵塞，增加IS风险[4-5]。

以血液为代表的循环体液是临床上最为常用的检材之一，在疾病快速诊断、疗效评价和预后监测中具有潜在应用价值[6-7]。近年来，随着代谢组学方法的蓬勃发展，色谱质谱联用、核磁共振等技术被广泛应用于脑卒中代谢标志物的研究，已从血液和脑脊液中发现了一批潜在标志物，如氨基酸、脂肪酸等[8-10], 但尚未有研究对这些数据进行系统、深入的挖掘。本研究首先对已报道的脑卒中相关血液代谢物信息进行搜集和整理，接着采用通路分析方法，分别计算与IS和HS发生发展密切相关的代谢途径，进而借助网络拓扑分析方法建立“代谢物-通路”作用网络模块，系统发掘了可能对IS诊断和预测有重要作用的代谢物及通路。

1 研究方法

1.1 缺血性脑卒中数据搜集

以“ischemic stroke” “cerebral infarction”和“metabolomics” “metabolite”为关键词，时间限度为2011—2020年，在PubMed(https: //pubmed. ncbi. nlm. nih. gov/)数据库进行检索，筛选以人血液为对象的IS代谢组学研究，排除重复及陈旧文献，纳入符合标准的文献，并结合HMDB 4.0(https: //hmdb. ca/)数据库信息整理IS相关代谢物。

1.2 出血性脑卒中数据搜集

采用相似方法，以“hemorrhagic stroke” “subarachnoid hemorrhage”和“metabolomics”“metabolite”为关键词，检索整理HS相关代谢物。由于所得文献较少，故增加“proteomics”为关键词，补充收集HS相关蛋白质。

1.3 代谢通路分析

针对收集的IS相关代谢物，采用MetaboAnalyst 4.0(http: //www. meta boanalyst. ca/)在线软件进行通路分析(Pathway analysis)。具体操作和参数如下: 将代谢物的HMDB ID输入Compound list对话框; Over representation analysis选择超几何分布检验(Hypergeometric test); Pathway topology analysis选择相对中介中心性(Relative-betweenness centrality); Pathway library选择KEGG (Oct2019), Mammals选择人类(Homo sapiens); 进行通路模型分析。

对收集的HS相关代谢物和蛋白，利用MetaboAnalyst 4.0的联合通路分析(Joint pathway analysis)模块进行分析。具体操作和参数如下: 分别将代谢物的HMDB ID和蛋白质的Entrez ID输入Metabolite list和Gene list对话框; Specify organism选择人类(Homo sapiens); KEGG版本选择Oct2019; Database type选择代谢通路[Metabolic pathways (integrated)]; Enrichment analysis选择超几何分布检验(Hypergeometric test); Topology measure选择点度中心性(Degree centrality); Integration method选择合并查询(Combine queries); 进行计算分析。

1.4 作用网络分析

基于收集到的与IS诊断和预测相关的所有代谢物，结合本课题组基于SMPDB(https: //smpdb.ca/)和KEGG(https://www. genome. jp/kegg/)数据库构建的人体代谢网络(Human metabolic network), 提取与IS发生发展相关的血液代谢物与代谢通路网络模块。在此基础上，采用开源网络分析软件Gephi 0.9.2构建互作网络模型，以特征向量中心性(Eigenvector centrality)和中介中心性(Betweenness centrality)排名前15%的通路节点为核心代谢通路，所涉及的代谢物为核心代谢标志物。

2 结 果

2.1 代谢标志物整理与分类

经筛选，共发现IS血液代谢组学研究论文17篇，涉及117个代谢物[11-27]。根据不同研究目的及采样时间(在IS发生前或发生后)，将代谢物分为诊断和预测标志物2类，经统计分别有86和46个(图1A); 其中赖氨酸、色氨酸、谷氨酰胺、肉毒碱、亚油酸等15个物质为2者共有。

图1B展示了在文献中出现频次较高(≥2)的31个代谢标志物的变化趋势。与正常组相比, IS患者血液中的异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、LysoPC(18∶2)等12个物质水平显著降低，而乳酸和尿酸水平升高。同时，异亮氨酸、亮氨酸、亚油酸的水平与IS风险成正相关，赖氨酸和缬氨酸的水平与IS风险呈负相关。此外，一些标志物的变化趋势在不同研究中存在差异，如脯氨酸、LysoPC(16∶0)、天冬氨酸、苯丙氨酸等。

A: 分别有86和46种代谢物与缺血性卒中(IS)诊断和预测相关; B: 在IS血液代谢组学研究中，被报道2次以上的代谢标志物的变化趋势和频率; C: 从出血性卒中(HS)代谢组学研究中收集的11种代谢标志物。Proline: 脯氨酸;Isoleucine: 异亮氨酸; Valine: 缬氨酸; LysoPC(16∶0): 溶血卵磷脂(16∶0); Glutamate: 谷氨酸; Creatinine: 肌酸酐;Serine: 丝氨酸; Methionine: 甲硫氨酸; LysoPC(18∶2): 溶血卵磷脂(18∶2); Lysine: 赖氨酸; Glycine: 甘氨酸;Carnitine: 肉毒碱; Alanine: 丙氨酸; S-Adenosyl-homocysteine: S-腺苷-同型半胱氨酸; Uric acid: 尿酸;Tyrosine: 酪氨酸; Tryptophan: 色氨酸; Threonine: 苏氨酸; Phenylalanine: 苯丙氨酸; Leucine: 亮氨酸; Lactate: 乳酸;Histidine: 组氨酸; Citric acid: 柠檬酸; Aspartate: 天冬氨酸; Linoleic acid: 亚油酸;Homocysteine sulfinic acid: 同型半胱氨酸亚磺酸; 2-Oxoglutarate: 2-酮戊二酸; Pyruvic acid: 丙酮酸;2-Phosphoglyceric acid: 2-磷酸甘油; 3-phosphoglyceric acid: 3-磷酸甘油; Succinyl-CoA: 琥珀酰辅酶A;ADP: 二磷酸腺苷; FAD: 核黄素; GTP: 三磷酸鸟苷; Oxalacetic acid: 草酰乙酸; cis-Aconitic acid: 顺-乌头酸。图1 脑卒中相关代谢标志物的结果

HS相关临床标志物研究报道较少，仅收集到以患者脑脊液为研究载体的代谢组学和蛋白质组学论文各1篇，整理出11个代谢物和9个蛋白质，其中代谢标志物如图2C所示[28-29]。

2.2 缺血性脑卒中通路分析

经通路分析发现, IS发生后，患者血液中有12条代谢通路显著改变(P<0.05), 包括甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成，精氨酸生物合成，叶酸一碳代谢，亚油酸代谢等(图2A)。此外，与IS低风险人群相比，高风险人群血液中有13条代谢通路变化显著(P<0.05), 包括嘌呤代谢、谷氨酰胺和谷氨酸代谢、精氨酸生物合成、丁酸酯代谢、酮体的合成与降解、亚油酸代谢等(图2B)。

A、B: 与缺血性脑卒中诊断和预测相关的代谢途径; C: 与出血性卒中显著相关的代谢途径。Aminoacyl-tRNA biosynthesis: 氨基酰-tRNA生物合成; Arginine biosynthesis: 精氨酸生物合成;Glycine, serine and threonine metabolism: 甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢;Phenylalanine, tyrosine and tryptophan biosynthesis: 苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成;Linoleic acid metabolism: 亚油酸代谢; Purine metabolism: 嘌呤代谢;Glutamine and glutamate metabolism: 谷氨酰胺和谷氨酸代谢; Citrate cycle (TCA cycle): 柠檬酸循环;Pyruvate metabolism: 丙酮酸代谢; Glyoxylate and dicarboxylate metabolism: 乙醛酸和二羧酸代谢。图2 缺血性脑卒中及出血性脑卒中的通路分析

2.3 出血性脑卒中通路分析

将HS相关代谢物和蛋白质进行联合通路分析，结果如图2C所示。与健康对照相比, HS患者有19条代谢通路发生显著变化(P<0.05), 包括丙酮酸代谢、丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代谢、糖酵解或糖异生通路、中心碳代谢、核黄素代谢等。

2.4 代谢物-通路作用网络

由于HS相关研究报道和数据有限，故本研究仅对IS构建了代谢物-通路作用网络。通过代谢物富集分析聚焦95条通路，其中9条具有统计学意义(P<0.05), 借助本课题自建的人体代谢网络提取网络模块，包含82个代谢物与95条通路的457个联系，进而利用Gephi软件构建“代谢物-通路”作用网络(Metabolite-pathway network)。结果如图3所示，NAD+、ATP、AMP、谷氨酸、酮戊二酸等物质的特征向量中心性和中介中心性较高(Top 10%), 提示其在IS发生发展中可能处于核心位置或发挥重要作用。

L-Valine: L-缬氨酸; L-Leucine: L-亮氨酸;L-Isoleucine: L-异亮氨酸; L-Glutamic acid: L-谷氨酸;Homocysteine: 同型半胱氨酸; ATP: 三磷酸腺苷;NAD+: 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸; Folic acid: 叶酸;Pyruvic acid: 丙酮酸; Ammonia recycling: 氨回收;Glycine and serine metabolism: 甘氨酸和丝氨酸代谢;Glutamate metabolism: 谷氨酸代谢;Valine, leucine and isoleucine degradation: 缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解。图3 缺血性卒中相关“代谢物-通路”作用网络

3 讨 论

目前, IS相关代谢组学研究报道较多(高质量论文17篇)，经整理和分析，本研究将发现的117个代谢物分为诊断和预测2类，其对IS的及时筛查、早期诊断、临床管理等具有重要意义。值得注意的是，有31个代谢物被不同研究多次报道，其中异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸等物质在各个研究中报道的变化趋势一致，这进一步证明了其结果的可靠性。此外，部分代谢物，如天冬氨酸、苯丙氨酸、肉碱等，在不同文献中报道的变化趋势不一致; 这可能是由于现有研究的样本量均较小(n<200), 人群的异质性以及分析技术的偏向性可能导致结果相反，同时也证明开展大样本、宽覆盖IS血液代谢组学研究的必要性。

通过构建“代谢物-通路”作用网络模块，作者发现NAD+、ATP、AMP等重要的能量代谢物质具有较高的节点度，提示能量代谢在IS病理变化中占有非常重要的地位。研究[30-31]表明，由于脑血管闭塞，神经细胞正常生理活动所需要的氧气和能量物质不能被及时送达，细胞不能通过正常途径产生足够的ATP供能，能量代谢障碍会导致Na+-K+-ATP酶活性降低，引发细胞膜去极化导致大量Ca2+内流以及细胞外谷氨酸聚集，造成线粒体功能障碍和结构损伤，同时水分子被动跟随钙离子流入细胞导致细胞毒性水肿。因此，增强能量代谢和维持线粒体稳定可能对调节IS的进程有一定的作用。

有趣的是，在IS高风险人群中异亮氨酸、亮氨酸水平较高; 而IS患者血液中支链氨基酸(BCAAs)含量则显著降低(图1B)。由于BCAAs不仅具有促进肌肉增长、蛋白质合成等作用，还可作为中间物质供给能量代谢[32-33], 因此在IS患者中观察到BCAAs水平降低可能是机体为了维持能量代谢稳态消耗所致。基于此，考虑到BCAAs均为《中华人民共和国药典》[34]收载的药物，那么直接补充BCAAs或抑制其代谢途径中的关键酶(如支链酮酸脱氢酶)，可能有助于IS患者的治疗和恢复。但是，对于为什么健康人BCAAs含量与IS风险呈正相关，目前尚无研究报道。

此外，由于未能收集到足够的HS代谢组学数据，本研究整合了蛋白质组学数据进行补充。与IS相比，作者发现了一些HS特有的代谢通路，如核黄素代谢等。在临床实践中, IS和HS的发病机制、治疗方案截然不同，对其进行准确区分具有重要意义。目前，计算机断层扫描(CT)是脑卒中患者临床诊断的主要手段，但该方法受制于设备数量、检测费用等条件，难以广泛应用[35-36]。因而，灵敏便捷的血液代谢标志物将有利于IS与HS患者的快速区分，特别适合在体检中心等场景下的临床使用。但由于文献资料较少，本研究仅收集到11个HS代谢标志物，所得结果还需更多大样本、多中心、多组学的研究数据支持。

综上所述，本研究从已报道的脑卒中代谢组学文献中收集和整理了128个差异代谢物，利用通路分析方法，分别聚焦与IS和HS紧密关联的代谢途径20条和19条; 进而结合基于SMPDB等数据库构建的人体代谢网络，利用图形化网络分析技术建立IS相关“代谢物-通路”作用网络模块，发现与IS发生发展密切相关的核心代谢通路12条、代谢物47个。本研究从系统生物学角度探寻脑卒中病理机制和临床代谢标志物，相关研究发现为脑卒中的治疗方法开发、临床管理等提供新的科学数据，但仍需更深入的验证发掘。