lncRNA TTN-AS1通过miR-519d-3p/MMP2调控肺腺癌A549细胞的活力和侵袭

刘 华， 张素兰， 梁天嵩， 王 娟， 赵静宜， 郑颖娟， 张相娴 ， 杨道科△

（1郑州大学基础医学院，河南郑州450001，2郑州大学第一附属医院肿瘤医院，河南郑州450052）

肺癌是发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一，严重威胁人类生命和健康。肺腺癌又是最常见的肺癌类型，虽然目前临床对其治疗取得一定的进展，然而其总体预后并不尽如人意［1］。

长链非编码RNA（long noncoding RNA，lncRNA）是一类不编码蛋白质的非编码RNA 分子，属于非编码RNA 的一员，其转录本大于200 nt。lncRNA 可以通过转录或转录后水平基因调控，抑制或沉默蛋白表达，参与生理和病理过程。目前很多研究表明lncRNA 在肿瘤发生发展中发挥重要作用，参与细胞增殖、周期、迁移、侵袭和凋亡等［2-3］。已有研究显示，lncRNA TTN 反义RNA 1（TTN antisense RNA 1，TTN-AS1）在乳腺癌、结直肠癌、食管癌、胃癌、前列腺、肺癌等多种肿瘤组织中呈现异常高表达，发挥癌基因的作用［4-7］。基于课题组前期工作的基础和生物信息学分析结果，提示TTN-AS1 可能通过 微 小 RNA-519d-3p （microRNA-519d-3p，miR-519d-3p）/基质金属蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2，MMP2）调控肺腺癌细胞的活力和侵袭。

因此，本研究通过检测肺腺癌组织中TTN-AS1的表达水平，观察沉默TTN-AS1 表达对人肺腺癌A549 细胞活力和侵袭的作用，探讨TTN-AS1 通过miR-519d-3p/MMP2 调控A549 细胞活力和侵袭的机制。

材料和方法

1 主要材料

人肺癌 A549、H299和H1975 细胞，人正常支气管上皮细胞BEAS-2B 及人胚肾293T 细胞购自中科院上海细胞库；Trizol和LipofectamineTM2000购于Invitrogen；胎牛血清和DMEM 培养液购于Gibco；miR-519d-3p mimic、miR-NC、si-lncRNA TTN-AS1 （silncRNA）和si-NC 由上海吉玛公司合成；报告基因载体pmirGLO 和双萤光素酶检测试剂盒购于Promega；Magna RNA 免 疫 沉 淀（RNA immunoprecipitation，RIP）试剂盒购于Millipore；抗MMP2 抗体、抗GAPDH抗体和酶标II 抗购于Abcam；BCA 蛋白检测试剂盒购于碧云天生物技术研究所；PCR 引物由北京擎科新业生物技术有限公司合成。7500 Fast 荧光定量PCR仪为ABI公司产品。

2 方法

2.1 标本采集 收集 2017 年 10 月～2018 年 12 月郑州大学第一附属医院32 例肺腺癌患者手术切除标本，均经病理证实为肺腺癌。患者年龄46～72 岁（56.26±4.72）。所有患者术前未接受放化疗或生物治疗，标本置于-196℃液氮保存。该研究经过郑州大学伦理委员会批准。

2.2 细胞培养和转染 A549、H299、H1975、BEAS-2B 和293T 细胞均用含10%胎牛血清和1%双抗的DMEM 培养液于 37℃、5% CO2培养。使用 LipofectamineTM2000 转染细胞，分为3 组：空白（blank）组（未转染的A549 细胞）、si-NC 组和si-lncRNA 组，每组均设5个重复。

2.3 RNA 提取和RT-qPCR 采用Trizol提取培养细胞和液氮研磨后的组织细胞中的总RNA。lncRNA使用通用引物逆转录，miR-519d-3p使用特异茎环引物逆转录。荧光定量PCR 扩增，相对表达水平以2-ΔΔCt表示；分别以 GAPDH 和U6为内参照。TTN-AS1的上游引物序列为5'-GCCAGGTAGAGTTGCAGGTT-3'，下游引物序列为5'-GAAGCTGCTGCGGATGAATG-3'；GAPDH 的上游引物序列为5'-GTCACCTTCACCGTTCCAGTTTT-3'，下游引物序列为5'-CTTAGTTGCGTTACACCCTTTCTT-3'；miR-519d-3p 的上游引物序列为 5'-TGCGGCAAAGTGCCTCCCTTTAG-3'，下游引物序列为5'-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3'；U6 的上游引物序列为5'-CTCGCTTCGGCAGCACATA-3'，下游引物序列为5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。

2.4 CCK8 实验 实验在96 孔细胞培养板中进行，各组细胞在培养的0、24、48 和72 h 进行测定。每孔加入10 μL CCK8 溶液，37℃孵育2 h，酶标仪450 nm测定各组细胞的吸光度（A）值，每组设置5个复孔［8］。

2.5 Transwell 实验 取 100 μL（含有 1×104个细胞）无胎牛血清培养液，接种于制备基质胶的Transwell 上室；下室加入250 μL 含胎牛血清的培养液，在37℃、5%CO2培养箱中常规培养24 h。取出小室，PBS 洗2 遍，多聚甲醇固定后结晶紫染色，显微镜下观察、计数穿膜细胞数，每组设置5个重复。

2.6 双萤光素酶报告基因实验 采用PCR 和overlap PCR 分别扩增包含野生型和突变型miR-519d-3p结合位点的TTN-AS1 片段，重组入pmirGLO 报告基因载体，得到野生型和突变型报告基因载体pmir-GLO-WT-TTN-AS1和pmirGLO-Mut-TTN-AS1。同样方法构建MMP23'UTR 的野生型和突变型报告基因载体 pmirGLO-WT-MMP2 UTR（WT-UTR）和 pmir-GLO-Mut-MMP2 UTR（Mut-UTR）。将野生型/突变型载体分别与miR-519d-3p mimic/miR-NC 共转染293T细胞，转染48 h，按照试剂盒说明书检测萤光素酶活性［9］。

2.7 Western blot 实验 RIPA 裂解细胞提取总蛋白，BCA 试剂盒检测蛋白浓度，SDS-PAGE 分离蛋白，半干转移法转至PVDF膜，脱脂奶粉封闭后，加入Ⅰ抗4℃孵育过夜；TBST 清洗，加入酶标Ⅱ抗孵育2 h，最后加入ECL 化学发光液置于凝胶成像系统中采集图像。

2.8 RIP 实验 使用Magna RIP 试剂盒（Millipore），按照说明书进行。收集A549 细胞，用RIP 裂解缓冲液裂解细胞；然后使用抗包覆抗人Ago2 抗体磁珠进行Ago2 免疫沉淀，同时使用IgG 抗体作为阴性对照。然后分离免疫沉淀RNA，RT-qPCR 检测结合部分中TTN-AS1和miR-519d-3p的丰度［10］。

3 统计学处理

用SPSS 24.0 软件对数据进行统计分析。计量数据以均数±标准差（mean±SD）表示，多组间均数比较均采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，检验水准α=0.05。

结 果

1 肺腺癌组织中TTN-AS1异常高水平表达

RT-qPCR 结果显示，32 例肺腺癌组织中TTNAS1 表达水平显著高于癌旁正常组织（P＜0.05），见图1A；与癌旁正常组织相比，肿瘤组织中miR-519d-3p 表达水平显著降低（P＜0.05），而MMP2 mRNA 表达水平显著升高（P＜0.05），见图1B、C。3 个肺癌细胞株A549、H299和H1975的TTN-AS1表达水平都显著高于人正常支气管上皮细胞BEAS-2B（P＜0.05），见图1D；这些肺癌细胞株miR-519d-3p 表达水平显著降低（P＜0.05），而MMP2 mRNA 表达水平显著升高（P＜0.05），见图1E、F。

Figure 1.The expression of TTN-AS1（A，D），miR-519d-3p（B，E）and MMP2 mRNA（C，F）in lung adenocarcinoma tissues（A～C；n=32）and cell lines（D～F；n=5）detected by RT-qPCR.Mean±SD.*P＜0.05 vs normal group；△P＜0.05 vs BEAS-2B group.图1 肺腺癌组织和细胞株中TTN-AS1、miR-519d-3p和MMP2 mRNA的表达

2 沉默TTN-AS1 表达可抑制A549 细胞的活力和侵袭

转染 si-lncRNA 的 A549 细胞 中 TTN-AS1 表达水平与 si-NC 组比较显著降低（P＜0.05），见图 2A。CCK8 结果显示，si-lncRNA 组细胞在 24、48和72 h时的A值均显著低于 blank 组（P＜0.05），见图 2B。Transwell 实验结果显示，si-lncRNA 组的穿膜细胞数 显著低于blank组和si-NC组（P＜0.05），见图2C。

Figure 2.The effect of TTN-AS1 expression knock-down on the viability and invasion of A549 cells.A：the expression of TTN-AS1 in the A549 cells after transfected with si-lncRNA；B：the effect of TTN-AS1 expression knock-down on the viability of A549 cells detected by CCK8 assay；C：the effect of TTN-AS1 expression knock-down on the invasion of A549 cells（scale bar=50 μm）.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs blank group；△P＜0.05 vs si-NC group..图2 沉默TTN-AS1表达对A549细胞活力和侵袭的影响

3 TTN-AS1负调控miR-519d-3p的表达

生物信息学分析TTN-AS1 与miR-519d-3p 存在吸附位点，见图3A。双萤光素酶报告基因实验结果显示，miR-519d-3p mimic 与野生型pmirGLO-WTTTN-AS1 共转染组细胞萤光素酶活性比其他对照组显著降低（P＜0.05），见图3B。RT-qPCR 结果显示，沉默TTN-AS1 表达的细胞中miR-519d-3p 表达水平与对照组相比显著升高（P＜0.05），见图3C。RIP 实验结果显示，A549 细胞中TTN-AS1 和miR-519d-3p在Ago2 免疫沉淀复合物中的含量显著高于IgG 免疫沉淀复合物（P＜0.05），见图3D。

Figure 3.TTN-AS1 negatively regulated miR-204-3p expression.A：the predicted binding sites between miR-519d-3p and TTNAS1；B：dual-luciferase reporter assay；C：the effect of TTN-AS1 silencing on the expression of miR-519d-3p in A549 cells；D：anti-Ago2 RIP was performed in HEK293T cells，followed by RT-qPCR to detect the expression of TTN-AS1 or miR-519d-3p associated with Ago2.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs si-NC group；#P＜0.05 vs WT-TTN+miR-NC group；△P＜0.05 vs anti-IgG group.图3 TTN-AS1负调控miR-519d-3p的表达

4 miR-519d-3p inhibitor 减弱 沉默 TTN-AS1 对细胞增殖和侵袭的抑制作用

为了证实TTN-AS1 通过miR-519d-3p 对细胞活力和侵袭发挥作用，我们将miR-519d-3p inhibitor（miR inhibitor）和 si-lncRNA 共转染入 A549 细胞，采用CCK8 和Transwell 实验观察其作用。CCK8 和Transwell 结果显示，si-lncRNA+miR inhibitor 组与 silncRNA 组比，细胞活力显著增强（P＜0.05），穿膜细胞数显著增多（P＜0.05），见图4。

Figure 4.miR-519d-3p inhibitor attenuated the inhibitory effect of TTN-AS1 on the viability and invasion of A549 cells.A：CCK8 assay was used to evaluated the viability of A549 cells；B：Transwell assay was used to evaluated the invasion of A549 cells（scale bar=50 μm）.Mean±SD. n=5.*P＜0.05 vs si-lncRNA group.图4 miR-519d-3p inhibitor减弱沉默TTN-AS1对细胞活力和侵袭的抑制作用

5 MMP2是miR-519d-3p的靶基因

通过miRbase网站预测，MMP2的3'UTR存在与miR-519d-3p 结合的种子区（seed region），见图5A。双萤光素酶报告基因实验结果显示，miR-519d-3p mimic 与WT-UTR 共转染组细胞萤光素酶活性比其他对照组显著降低（P＜0.05），见图5B。Western blot结果显示，与blank 组和miR-NC 组相比，转染miR-519d-3p mimic 的细胞中MMP2 蛋白表达量显著降低，见图5C。

Figure 5. MMP2 was the target gene of miR-519d-3p.A：miR-519d-3p and its putative binding sequences in the 3'UTR of MMP2；B：dual-luciferase reporter assay；C：miR-519d-3p overexpression reduced the protein expression of MMP2.Mean±SD. n=5.*P＜0.05 vs WT-UTR+miR-NC group.图5 MMP2是miR-519d-3p的靶基因

6 过表达MMP2减弱沉默TTN-AS1表达和过表达miR-519d-3p对A549细胞侵袭的抑制作用

为了进一步证实TTN-AS1 通过miR-519d-3p/MMP2 影响A549 细胞的侵袭能力，我们进行了过表达MMP2 的回复实验，结果显示，pcDNA3.1-MMP2与si-lncRNA 或miR-519d-3p mimic 共转染后的穿膜细胞数比单独转染si-lncRNA 或miR-519d-3p mimic均显著增加（P＜0.05），见图6。

Figure 6.Rescure experiment of overexpression of MMP2.The invasion of A549 cells was determined by Transwell assay（scale bar=50 μm）.Overexpression of MMP2 attenuated the inhibitory effect of TTN-AS1 silencing or miR-519d-3p overexpression on invasion of A549 cells.Mean±SD. n=5.*P＜0.05 vs si-lncRNA group；#P＜0.05 vs miR-519d-3p group.图6 过表达MMP2的回复实验

讨 论

Zhong 等［7］研究显示在肺腺癌组织中 TTN-AS1不仅高表达，且其表达水平与TNM 分期和生存期相关，TTN-AS1 表达水平与TNM 分期正相关，与生存期负相关。本研究结果显示，32 例肺腺癌组织中TTN-AS1表达水平显著高于癌旁正常组织；并且3个肺癌细胞株A549、H299和H1975的TTN-AS1表达水平也都显著高于人正常支气管上皮细胞BEAS-2B。这个结果再次证实了肺腺癌组织中TTN-AS1 呈现异常高表达的现象，提示TTN-AS1 有可能成为肺腺癌的潜在辅助标志物。

TTN-AS1 位于 2 号染色体，长度 1 077 bp，它能通过海绵吸附的方式调控多种microRNA，从而影响肿瘤的生物学过程。Zhu 等［6］报道 TTN-AS1 通过吸附miR-1271 影响前列腺癌细胞的增殖和侵袭；Wang 等［5］和 Li 等［11］分别 报 道 TTN-AS1 通 过吸 附miR-376a-3p 促进结直肠癌和骨肉瘤细胞增殖和侵袭能力；Jia 等［12］和 Zhong 等［7］分别报道它可以吸附miR-142-5p 和miR-4677-3p 促进肺腺癌细胞的侵袭和上皮-间充质转化。本研究通过双萤光素酶报告基因实验和RIP 实验证实TTN-AS1 能够与miR-519d-3p通过预测的吸附位点吸附结合；RT-qPCR检测沉默 TTN-AS1 表达对 A549 细胞中 miR-519d-3p 表达水平的影响，进一步证实在肺腺癌细胞中TTNAS1 可以通过海绵吸附的方式负调控miR-519d-3p的表达。这个海绵吸附调控通路尚未见有报道，与已报道的TTN-AS1 对microRNA 的吸附位点相比，TTN-AS1 与miR-519d-3p 吸附位点的互补碱基数达到8（图3A），是已报道结合位点中互补碱基数最多的，这可能是其调控作用较强的一个重要原因。

本研究通过生物信息学预测、双萤光素酶报告基因实验和Western blot 实验证实MMP2是miR-519d-3p 下游靶基因，miR-519d-3p 可以与MMP2 的3'UTR 结合，负调控其表达。MMP2是参与细胞侵袭和迁移的重要一员［13］，为了进一步证实TTN-AS1 通过miR-519d-3p/MMP2 影响A549 细胞的侵袭能力，我们进行了Transwell 的实验，结果显示miR-519d-3p inhibitor 可回复沉默TTN-AS1 对细胞侵袭的抑制作用，提示沉默TTN-AS1对细胞侵袭的抑制作用，需通过miR-519d-3p；过表达MMP2 可以部分回复TTNAS1和miR-519d-3p 对 A549 细胞侵袭的作用，提示TTN-AS1和miR-519d-3p 对 A549 细胞侵袭的作用，都需通过MMP2。这说明肺腺癌细胞中也存在不同于 Jia 等［12］和 Zhong 等［7］描述的 TTN-AS1 调控通路，即TTN-AS1 通过miR-519d-3p/MMP2 调控细胞侵袭能力的通路。

综上所述，本研究提示肺腺癌组织中lncRNA TTN-AS1呈现异常表达情况，可能通过miR-519d-3p/MMP2参与细胞的侵袭过程。