CCN蛋白对肥胖症和非酒精性脂肪肝防治机制的研究进展*

杨 婧， 赵耀伟， 高 红， 赵丽莉

（1黑龙江中医药大学，2哈尔滨医科大学附属第四医院，黑龙江哈尔滨150000）

CCN 由富半胱氨酸蛋白61（cysteine-rich protein 61，CYR61）、结缔组织生长因子（connective tissue growth factor，CTGF）和肾母细胞瘤过表达蛋白（nephroblastoma overexpressed protein，NOV）的首字母缩写而来。CCN 家族是一类具有半胱氨酸富集特性的基质细胞蛋白（matricellular proteins），包括CCN1～6 等家族成员（其中CCN1 即CYR61，CCN2 即CTGF，CCN3 即NOV），具有广泛的生物学功能。它们通过与细胞表面的各种整合素直接结合或与多种细胞生长因子相互作用来调控各种因子的生物活性，还可通过信号途径相互作用来改变细胞生长因子的具体作用［1］，从而参与细胞的生长、黏附和迁移过程。CCN 蛋白在肥胖症和非酒精性脂肪肝及其并发症中的炎症调控、创伤修复、纤维性疾病等方面均发挥重要作用。

1 CCN蛋白与脂肪细胞活化的调控

肥胖本身也是一种慢性炎症状态。研究发现，肥胖患者血浆中的炎症细胞因子浓度升高，如肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）和C 反应蛋白（C-reactive protein，CRP）。脂肪组织不仅是能量储存器官，同时也是重要的内分泌组织，可分泌多种脂肪细胞因子来调节机体的能量平衡，并在肥胖相关的炎症和代谢紊乱方面发挥重要作用。脂肪细胞因子由脂肪细胞或脂肪组织巨噬细胞所产生，包括瘦素、脂联素、抵抗素和内脂素，同时也包括促炎细胞因子和抗炎细胞因子，例如TNF-α、IL-6、IL-1β 和单核细胞趋化蛋白1（monocyte chemoattractant protein 1，MCP1）等［2］。由于人们身体储存多余热量转化为脂肪并通过产热来消耗热量的能力不同，因此在脂肪组织不易产热和不易将能量储存在皮下脂肪中的人群中，他们就更易出现低度系统性炎症［3］。

体外模拟脂肪生成是一个多步骤的过程，首先逐步确定间充质干细胞，然后将其定型为脂肪细胞谱系，并最终分化为成熟的脂肪细胞，其中脂肪细胞分化（fat cell differentiation，FCD）增强了脂肪细胞特性，包括脂质存储和胰岛素敏感性。CCN2 可抑制NIH3T3-L1 细胞的脂肪细胞分化和分离自小鼠附睾脂肪垫的脂肪细胞中的FCD，而CCN2对FCD的作用依赖于转化生长因子β（transforming growth factor β，TGF-β）及其下游通路的信号传导。其中TGF-β1是脂肪形成的关键负调节剂，通过其细胞经典信号传导因子SMAD 起作用。在动物和人类肥胖症中均观察到 TGF-β1 的 mRNA 水平升高。TGF-β1 的下游介体之一是CCN2，它可能通过自分泌和旁分泌细胞回路起作用，以调节组织（例如骨和软骨）中的细胞增殖、生长及分化［4］。

迄今为止，对于CCN 蛋白在脂肪细胞中作用机制的研究是有限的。Tan 等［5］发现 CCN2 对体外培养的小鼠NIH3T3L1 细胞和原代培养的小鼠脂肪细胞具有抑制作用。Song 等［4］证明这是通过 TGF-β 途径依赖机制发生的，并涉及FCD 中的关键早期转录因子——CCAAT/增强子结合蛋白（CCAAT/enhancerbinding protein，CEBP），特别是 CEBP-β和CEBP-δ。Tan 等［6］在高脂肪饮食环境中诱导肥胖的研究表明，肥胖小鼠脂肪组织中CCN2的mRNA 上调，而在不易增重的小鼠中的上调幅度较低。Pellegrinelli 等［7］在人体研究中发现，CCN2 表达与来自肥胖个体的白色脂肪组织中近脂肪细胞纤维化的量呈正相关，这表明CCN2 的高表达可能会损害脂肪细胞功能。而Si 等［8］和 Battula 等［9］的研究表明，CCN2 通过细胞机制（包括Wnt 信号传导）抑制间充质干细胞向脂肪细胞谱系的分化，而优先向成骨细胞谱系分化。总的来说，这些数据表明脂肪组织中的CCN2可能不同程度地影响间充质干细胞向脂肪细胞的分化，抑制初始和终末脂肪细胞的分化，并且还导致肥胖和脂质代谢功能障碍［3］。

如前所述，CCN 蛋白与脂肪细胞分化密切相关：一方面CCN2的表达与脂肪细胞的生长分化呈正相关，最终影响脂肪细胞功能；另一方面脂肪CCN2表达高低与小鼠肥胖程度密切相关。这可能为肥胖及其相关并发症的研究提供了新思路及新靶点。已知CCN2参与脂肪细胞分化，需要进一步研究高脂肪和高热量喂养的条件下，CCN2基因敲除小鼠和CCN2 高表达小鼠在热量消耗方面的差异，观察CCN2是否会影响脂肪组织的褐变，从而通过产热影响能量消耗。

2 CCN蛋白与非酒精性脂肪肝症状的发生机制

2.1 CCN 蛋白调控非酒精性脂肪肝的纤维化 非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是指非过度饮酒及其它明确损肝因素所致的、以肝细胞内大量脂肪沉积为主要特征的疾病。Williams 等［10］在 NAFLD 的常见代谢情况下进行研究，发现作为其诱因之一的糖尿病，在人类和小鼠模型会诱发更严重的NALFD 纤维化形式，称为非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）。Rachfal 等［11］的研究表明，在纤维化肝脏中，CCN2 的mRNA 和蛋白由成纤维细胞、肌成纤维细胞、肝星状细胞、内皮细胞和胆管上皮细胞产生。Lo等［12］发现，高脂喂养的糖尿病小鼠模型的肝细胞中CCN2 的mRNA 和蛋白表达水平显著升高，而 Twigg［3］使用中和性多克隆抗CCN2 抗体阻断CCN2 蛋白，可部分预防糖尿病 NASH 模型中的纤维化。Paradis 等［13］的研究表明，CCN2表达在人类NASH 纤维化肝脏和血液中升高。Tong等［14］发现，在肝细胞过表达人CCN2的转基因小鼠中加剧致病刺激，如四氯化碳和胆管结扎，导致肝纤维化风险增加。Chen等［15］的研究表明，外泌体中的关键微小RNA 可能会调节促纤维化活化的肝星状细胞中CCN2的表达，这表明对于纤维化运用此方法可能是未来治疗的趋势。Kim 等［16］认为采用系统性CCN1治疗，有助于预防在高脂肪喂养的NAFLD小鼠模型中的纤维化。

CCN 蛋白作为代谢性疾病发生发展的关键靶点，迄今为止尚未将CCN 与NAFLD 相结合的研究，因此在今后的疾病研究中应该对这一空白加以弥补，为CCN蛋白研究扩展新领域。

2.2 CCN 蛋白调控非酒精性脂肪肝的炎症反应非酒精性脂肪肝并发的炎症大多是由营养和能量过剩所致，是参与代谢的组织细胞的一种免疫应答。NASH 作为较为严重的一种NAFLD 病理类型，发展成为肝纤维化、肝硬化等的风险性较大。“多重平行打击”学说认为NASH 是多种机制共同作用的结果，较为准确地解释了NASH 的发病机制，包括内质网应激（endoplasmic retieulum stress，ERS）、细胞凋亡、自噬、相关脂肪因子紊乱和肠道菌群因素等在内的多种因素参与了其发病过程［17］。在这一过程中，参与代谢的组织（脂肪、肝脏、肌肉等）中TNF-α、IL-6等炎症因子的水平升高［18］。Haukeland 等［19］对 22 例NAFLD 患者和25 例NASH 患者的血清与同年龄、同性别的健康人血清进行对比分析，发现两组患者血清中炎症因子IL-6、TNF-α等的水平与对照组相比显著升高。

CCN1 通过激活巨噬细胞中NF-κB，上调炎症因子和趋化因子的表达，通过其细胞表面受体整合素αMβ2和syndecan-4诱导巨噬细胞中经典激活的M1型应答的基因表达变化，导致促炎细胞因子TNF-α、IL-1β 和IL-6 的表达升高，IFNγ 和趋化因子（包括MIP-1α、MCP-3、Gro1、Gro2和IP-10）亦升高。这些因素可募集并激活更多的炎症细胞，包括多形核中性粒细胞、单核/巨噬细胞和T淋巴细胞。同时，抗炎效应子如 TGF-β1和IL-10Rβ 的表达减弱，导致炎症反应的进一步扩大［20］。Mo 等［21-22］认为CCN1是胚胎发生过程中心血管发育的一个必需基因，而Lau［23］发现，成年期CCN1 的表达与炎症密切相关。在炎症细胞迁移和浸润过程中，炎症刺激激活内皮细胞，并表达黏附分子和细胞因子，而这些正是炎症细胞在炎症反应中的补体。CCN1和CCN2同样在免疫细胞补体激活过程中起到重要作用［24］。Jun 等［25］和 Kubota 等［26］分别研究发现，CCN1 和CCN 家族的其他成员在组织损伤、慢性疾病和相关病理过程中的表达升高，包括动物模型和人类患者中的纤维化和癌症。

现有研究多针对于CCN 蛋白与风湿等炎症反应，但对于代谢性炎症的研究较少，随着非酒精性脂肪肝患病率的逐年升高，CCN 与非酒精性脂肪肝炎症反应的关系或成为未来研究方向之一。

3 CCN 蛋白与非酒精性脂肪肝及其并发症损伤的修复

3.1 CCN 蛋白调节胆管细胞分化修复损伤 肝脏是高度可再生器官，CCN1 在肝胆损伤修复的增殖和成熟阶段起着关键作用。肝细胞和胆管细胞是肝脏的两种不同上皮细胞类型，它们对损伤的反应不同。在肝脏中，CCN1 在二乙基亚硝胺诱导的肝癌中抑制肝细胞代偿性增殖，从而抑制肿瘤的发生；然而，当胆汁淤积损伤胆管细胞，CCN1 诱导胆管细胞增殖和胆管再生。

在胆汁淤积性损伤中，增殖期的主要修复反应是胆管反应，包括胆管细胞增生、胆管扩张、肝祖细胞向胆管细胞的分化等。Kim 等［27］发现，CCN1对于因胆管结扎（bile duct ligation，BDL）或3，5-二乙氧基羰基-1，4-二氢可力丁（3，5-diethoxycarbonyl-1，4-dihydrocollidine，DDC）饮食造成的损伤后胆管再生至关重要，后者是模拟人胆汁淤积性肝病的实验模型。Ccn1D125A/D125A小鼠在BDL 之后的几天内死亡，而野生型小鼠在相同实验中存活下来。Ccn1D125A/D125A小鼠快速死亡是由于未发生胆管反应，胆汁酸不能排入胆囊和肠道，而外漏入肝实质，造成大面积肝坏死。此外，研究发现CCN1通过整合素αVβ5在胆管细胞中的参与而发挥作用，从而激活NF-κB 介导的JAG1 表达和胆管细胞增生所需的JAG1/NOTCH 信号。Kim等［27］和 Boulter 等［28］发现，CCN1 还激活肝星状细胞中JAG1 的表达，通过JAG1/NOTCH 信号通路与肝祖细胞相互作用，诱导肝祖细胞向胆管细胞分化，促进胆管再生。其机制可能与肝星状细胞激活后分泌的JAG1 调节下游靶基因SOX9和Hes1在肝祖细胞中表达有关，SOX9和Hes1 作为 JAG1/NOTCH 信号通路下游重要的信号分子，在胚胎胆管的形成发展中起重要作用［29］，最终调控肝祖细胞向胆管细胞分化，促进胆管细胞增生，修复胆管损伤。

这些研究结果表明，CCN1 通过激活αVβ5介导的 NF-κB和JAG1/NOTCH 信号通路而发挥作用，因此它对于胆管损伤再生中的胆管反应是必不可少的。

3.2 CCN 蛋白对肝细胞纤维化的双向调控 肝纤维化是多种慢性肝损伤导致的病理性修复反应，其特征在于肝脏内肌成纤维细胞大量增生和其带来的细胞外基质（extracellular matrix，ECM）蛋白过度沉积。近年来，人们开始探索CCN 蛋白在调控肝纤维化中的作用机制，尤其是它们在肝星状细胞激活中的作用。肝星状细胞位于肝窦内皮细胞和肝细胞之间的窦间隙Disse 腔中，在正常肝脏内处于静息状态，作为肝纤维化的原发效应细胞，活化的肝星状细胞分化为成纤维细胞，产生大量的ECM［30］。CCN1～5在肝星状细胞活化过程中的表达均呈现上调的趋势，其中CCN2 可显著增强肝星状细胞的激活表型，这是肝星状细胞表型转化的中心通路；CCN4 具有促进纤维化的调控作用；CCN1 则可表现出抑制纤维化作用；而 CCN3和CCN5 一起，可减轻 CCN2 和CCN4的促进纤维化作用［31］。

CCN1 加速成熟阶段的基质重塑，并限制纤维化，当肝脏遭受慢性损伤或由于肝毒素（如四氯化碳）中毒或胆汁淤积引起的损伤时，成纤维细胞被激活，产生 ECM，从而修复损伤组织。Kim 等［16］发现，在四氯化碳中毒和胆汁淤积2 种损伤模型中，CCN1通过诱导成纤维细胞衰老来抑制和限制纤维化，从而导致抗纤维化的衰老相关分泌表型（senescenceassociated secretory phenotype，SASP）蛋白的表达。Kim 等［16］和 Borkham-Kamphorst 等［32］发现，肝细胞特异性缺失CCN1的小鼠患有加重的纤维化，并伴有成纤维细胞衰老缺陷，肝细胞中CCN1的过表达加速成纤维细胞衰老从而减少肝纤维化。

此外，研究发现施用纯化的CCN1蛋白会加速预先建立的纤维化的消退。通过触发肝成纤维细胞中的细胞衰老，CCN1 阻止了这些产生ECM 的细胞的增殖并将其转化为ECM 降解的细胞，从而加速了纤维化的消退。CCN1 在肝损伤前期激活肝星状细胞以修复损伤，在后期限制纤维化以促进组织完整性，因此CCN1在肝损伤修复过程中扮演重要角色。

3.3 CCN1 对非酒精性脂肪肝并发症的调控 非酒精性脂肪肝与糖尿病的发生密切相关，而慢性皮肤损伤是糖尿病最为常见也最为严重的一种并发症。目前研究认为，由于糖尿病患者血糖、血脂等基础代谢失调致使局部皮肤微环境紊乱，继而影响到损伤部位参与创面修复的细胞的功能，最后伤口发生持续炎症及愈合障碍［33］。

Stramer 等［34］和 Gurtner 等［35］发现，在伤口愈合和损伤修复过程中，无论器官或组织如何，通常都要经历3 个阶段，这3 个阶段在时间上重叠但功能上不同：在初始阶段，免疫细胞对抗微生物并清除细胞碎片；在增殖阶段，肌成纤维细胞产生大量ECM，以促进组织完整性和实质细胞的增殖；最后，在成熟阶段重建临时ECM，以重建原始未损伤组织的结构。由于CNN1结构的特殊性及受体的多样性，决定了其广泛参与了机体胚胎发育、创口愈合、炎症起始等病理生理过程［36］。

Lau［37］证明CCN1通过特异性整合素受体与不同细胞类型相互作用，从而调节损伤修复的每个阶段。Jun 等［38］认为，在皮肤损伤后，CCN1 在炎症期和成熟期以双向方式被上调：在炎症期，通过结合巨噬细胞和凋亡细胞中的整合素 αVβ3/αVβ5，CCN1 作为一种桥接分子刺激中性粒细胞清除；在成熟阶段，CCN1 通过整合素α6β1结合到肌成纤维细胞的CT 结构域，从而触发肌成纤维细胞衰老来抑制和限制纤维化。在皮肤伤口愈合的炎症阶段，CCN1 的一个显著活性是刺激凋亡细胞的吞噬清除。中性粒细胞的浸润是创伤后最先发生的事件之一，以抵御微生物感染。然而，中性粒细胞寿命短暂，并迅速经历凋亡和坏死。Silva［39］发现，凋亡的中性粒细胞必须被移除才能继续愈合，因为这些细胞会发生继发性坏死，并分泌蛋白酶和细胞因子，导致进一步的组织损伤。从机理上讲，CCN1 作为桥接分子，与磷脂酰丝氨酸结合，磷脂酰丝氨酸是凋亡细胞上的吞噬信号，与巨噬细胞中的αVβ3/αVβ5结合，从而触发凋亡中性粒细胞的吞噬清除，见图1［40］。 Jun 等［38］发现，Ccn1D125A/D125A小鼠的伤口缺乏由CCN1 介导的凋亡中性粒细胞清除，停滞在炎症阶段，导致向增殖阶段的进展受阻。

Figure 1.The role of CCN1 in wound healing［40］.In the inflammatory phase，CCN1 stimulates the clearance of apoptotic neutrophils，allowing wound healing to progress to the proliferation phase in which myofibroblasts produce extracellular matrix（ECM）to promote tissue integrity.During the maturation phase，CCN1 induces cellular senescence in myofibroblasts to stimulate matrix remodeling and limit fibrosis.图1 CCN1在伤口愈合过程中的作用

Jun 等［41］发现，在增殖阶段，成纤维细胞、周细胞和间充质干细胞样细胞可转分化为肌成纤维细胞并产生ECM，以促进组织完整性和细胞增殖，当愈合进入成熟阶段时，则会通过经历凋亡、衰老、去分化或谱系重编程而停止产生ECM。然而，Bochaton-Piallat等［42］和Wynn等［43］均认为，如果损伤是慢性的或伤口愈合不受控制，肌成纤维细胞不受控制的刺激会导致纤维化瘢痕形成和器官功能丧失。Jun 等［38］发现，皮肤创伤的炎症阶段之后，CCN1 水平下降，但在愈合阶段又上升。CCN 蛋白与皮肤创面修复关系密切，因此在肥胖、非酒精性脂肪肝等基础代谢失调致使局部皮肤损伤以及损伤修复障碍的研究中，CCN蛋白可以作为一个新靶点和新方向。

4 结语

CCN 蛋白参与肥胖和非酒精性脂肪肝发生、发展过程中关键细胞信号通路的调控，但目前对于CCN 家族成员的蛋白生物学功能在肥胖和非酒精性脂肪肝中作用机制的研究较为有限，主要集中在CCN1 和CCN2 分子水平的调控和作用机制。因此，CCN 家族蛋白的生物学特性、作用机制和临床应用有更广阔的研究空间。这些研究对于今后进一步阐明肥胖和非酒精性脂肪肝发生、发展及预后的分子机制具有重要意义，而且CCN蛋白可能在基因诊断、基因治疗及转归预后等方面有较大临床应用前景。