PLIN3在肺腺癌组织和细胞中的表达及与预后的关系*

王雪婷， 张丽萍， 周丹丹， 郑 荃， 牟青杰， 张宝刚， 李洪利 ， 尹崇高

（潍坊医学院 1生命科学与技术学院，2病理学教研室，3临床学院，4医学研究实验中心，5护理学院，山东潍坊261053）

肺癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率逐年增长，对人类的生命健康存在极大威胁。肺腺癌（lung adenocarcinoma，LUAD）是肺癌的一种，在过去20多年中，许多国家的LUAD 发病率一直在增加［1-2］。长期以来转移性LUAD 患者的治疗都是姑息性的，然而其整体治愈率和存活率仍然很低，改善LUAD 的预后是提高整体治愈率和存活率的关键［3］。因此研究与LUAD 不良预后相关的基因，可为LUAD的临床治疗提供新的靶点。

围脂滴蛋白3（perilipin 3，PLIN3）是围脂滴蛋白家族成员之一，据报道其参与了脂滴的形成和积累。围脂滴蛋白家族参与脂代谢的调控，其表达失调可能与肥胖、糖尿病和胰岛素抵抗等疾病有关［4-5］。研究表明，围脂滴蛋白表达失调可能影响浆液性卵巢癌［6］和乳腺癌［7］等肿瘤的进展。然而，PLIN3 在LUAD中的表达水平、诊断和预后价值以及对肺腺癌细胞侵袭能力的影响尚不清楚。

本研究应用HPA 数据库筛选LUAD 不良预后相关的基因，运用GEPIA 数据库和Ualcan 数据库进一步验证了PLIN3 在LUAD 中的表达及与患者预后的相关性，此外，通过构建siPLIN3 质粒研究了PLIN3对LUAD细胞侵袭能力的影响。

材料和方法

1 主要材料

Lipofectamine 2000 购自 Invitrogen；胎牛血清购自HyClone；Transwell小室购自Corning，Matrigal胶购自BD；鼠抗人β-actin 单抗与兔抗人PLIN3 单抗购自Abcam。

2 主要方法

2.1 The Human Protein Atlas（HPA）数据库 HPA数据库（https：//www.proteinatlas.org/）基于综合组学方法，将基于抗体的蛋白质表达谱分析与高通量的mRNA 测序（RNA-Seq）相结合［7］。本研究使用HAP数据库中公开的蛋白质和RNA 表达数据集寻找可作为潜在生物标记的基因。首先查找肺癌中高表达且与不良预后相关的基因，之后分析该基因与肺癌及LUAD 亚型患者生存率的相关性，发现该基因在LUAD中存在更显著的相关性。

2.2 GEPIA 数据库 运用GEPIA 数据库（http：//gepia.cancer-pku.cn/），分析 PLIN3 在 LUAD 患者中基因表达的情况，并进一步验证PLIN3与LUAD患者生存率的相关性。

2.3 Ualcan 数据库 本研究使用Ualcan 数据库（http：//ualcan.path.uab.edu/index.html）中的数据，根据LUAD 肿瘤分级、肿瘤淋巴结转移分期等临床病理特征，分析PLIN3 表达水平与临床病理特征的关系。

2.4 细胞培养及转染 细胞培养及转染条件参照文献实施［8］，分组为：（1）A549 组：不转入质粒；（2）Scr/A549 组：转入空载质粒；（3）siPLIN3/A549 组：转入PLIN3小干扰质粒。

2.5 Western blot 实验 转染后提取各组细胞总蛋白，经10%SDS-PAGE 分离蛋白，转膜，封闭。孵育Ⅰ抗，抗体浓度分别为 β-actin（1∶1 000）和 PLIN3（1∶500）。孵育Ⅱ抗、显影并行定量分析。实验重复3次。

2.6 Transwell 侵袭实验 取转染后细胞浓度为4×109/L 的悬液 150 μL，加入 Transwell 小室上室中，下室加入含20%胎牛血清的培养基500 μL，培养24 h。之后4%多聚甲醛固定20 min，Giemsa 染色45 min，PBS 洗涤3 次。显微镜下随机选取5 个视野拍照计数，取穿过基质胶的细胞平均数为实验结果，实验重复3次。

3 统计学处理

HAP 数据库、GEPIA 数据库和 Ualcan 数据库中导出的生存曲线及箱线图采用数据库网站中的统计分析方法，其中箱线图数据的表达格式为中位数。使用SPSS 17.0软件对体外实验结果进行分析，实验数据均用均数±标准差（mean±SD）表示，两组定量资料均数比较采用独立样本t检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1 应用HPA数据库选取PLIN3为目的基因

从HPA数据库中查找与肺癌不良预后相关的基因，首先将得到的354个基因以FPKM 值表示转录水平进行排序，再结合与不良预后相关的前20 个最重要基因，经查阅文献，选取肺癌中未见报道过的PLIN3为研究对象。

2 PLIN3 在LUAD 组织中高表达且与LUAD 患者生存率显著相关

根据HPA 数据库跟踪785 例PLIN3 低表达肺癌患者和209例高表达患者（以FPKM 值衡量基因表达水平），发现低表达患者的5年生存率为48%，高表达患者的5 年生存率为34%（图1A）；跟踪343 例PLIN3低表达LUAD 患者和157 例高表达LUAD 患者，发现低表达患者的5 年生存率为47%，高表达患者的5 年生存率为25%（图1B）。LUAD 亚型的生存率分析显示，PLIN3 与LUAD 患者生存率存在显著的相关性。运用GEPIA 数据库分析PLIN3 在347 例正常肺组织和483 例LUAD 组织中的表达差异，发现LUAD 中PLIN3高表达（图1C）。运用GEPIA 数据库进一步对LUAD 中PLIN3表达差异情况进行生存分析，发现与PLIN3 低表达组相比，PLIN3 高表达组的总生存率较低（图1D）。

Figure 1. PLIN3 was the related gene of bad prognosis of LUAD in HPA database and GEPIA database.A，B：the relationship between PLIN3 and the survival rate of lung cancer and LUAD patients and the distribution of PLIN3 FPKM in patients；C：GEPIA database verifying the expression difference of PLIN3 in LUAD tissue；D：GEPIA database verifying the relationship between PLIN3 and survival rate in LUAD.图1 在HPA数据库及GEPIA数据库中PLIN3是LUAD不良预后的相关基因

3 Ualcan 数据库分析PLIN3 在LUAD 中的表达情况

采用Ualcan 数据库中TCGA 数据分析PLIN3 在59例正常肺组织和515例LUAD组织中的表达差异，发现PLIN3 在LUAD 组织中高表达（P＜0.01），见图2A。根据PLIN3 在LUAD 中的表达及其与肿瘤分级的关系，发现肿瘤分级高的患者其PLIN3 的表达也高（图2B）。PLIN3 与LUAD 淋巴结转移也有相关性，与正常肺组织相比，PLIN3在N0，N1，N2的LUAD患者中的表达差异有统计学意义，腋窝淋巴结转移结节数增加，PLIN3 表达也升高（图2C）。并且发现LUAD 患者中不同性别之间PLIN3 的表达无明显差异（图2D）。

Figure 2.The expression of PLIN3 in LUAD was detected by Ualcan database.A：the different expression of PLIN3 in normal and LUAD tissues；B：the different expression of PLIN3 in different stages of LUAD；C：the different expression of PLIN3 in lymph node metastasis status of LUAD；D：the different expression of PLIN3 in LUAD of different genders.*P＜0.05 vs normal group.图2 采用Ualcan数据库分析PLIN3在LUAD中的表达情况

4 体外实验验证PLIN3在LUAD细胞中呈高表达

Western blot 检测PLIN3 的表达情况，结果显示，PLIN3在肺腺癌细胞A549中的表达明显高于人正常肺上皮细胞BEAS-2B（P＜0.05），表明PLIN3 在A549细胞中高表达。质粒转染A549 细胞24 h 后，Western blot检测转染效率，与对照组Scr/A549相比，敲减PLIN3（siPLIN3/A549）组中PLIN3 的表达量显著降低，表明转染成功，见图3。

5 PLIN3促进A549细胞的侵袭

质粒转染 A549 细胞 24 h 后，通过 Transwell 侵袭实验检测细胞的侵袭能力，与Scr/A549 组相比，siPLIN3/A549 组穿过基膜的细胞数量显著减少（P＜0.05）。结果表明，敲减PLIN3的表达可以抑制肺腺癌细胞A549的侵袭能力，见图4。

讨 论

肺癌是全世界肿瘤死亡的主要原因，患者被诊断出肺癌时通常处于晚期阶段。根据临床和组织病理特征肺癌大致可分为非小细胞肺癌（non-smallcell lung cancer，NSCLC；占肺癌诊断的近80%）和小细胞肺癌（small-cell lung carcinoma，SCLC；占20%），其中NSCLC 又可以分为鳞状细胞癌、大细胞癌和腺癌［1］。在过去20多年中，许多国家的SCLC 发病率持续下降［9-10］。但70%以上的NSCLC 患者在诊断时处于晚期或已转移（III、IV 期）［11-12］。虽然近25 年来肺癌的诊治取得了很大进展，但患者的预后仍不理想。

Figure 3.Western blot analysis was used to detected the PLIN3 expression.A：the expression of PLIN3 in BEAS-2B cells and A549 cells；B：the expression of PLIN3 in A549 cells，Scr/A549 cells and siPLIN3/A549 cells.Mean±SD. n=3.#P＜0.05 vs BEAS-2B cells；*P＜0.05 vs Scr/A549 cells.图3 Western blot检测PLIN3的表达情况

Figure 4.The invasiveness of A549 cells was detected by Transwell assay.Mean±SD. n=3. *P＜0.05 vs Scr/A549 cells.图4 Transwell侵袭实验检测转染siPLIN3后A549细胞的侵袭能力

围脂滴蛋白高度磷酸化，定位于脂滴表面，可以通过调节脂肪组织中甘油三酯的代谢调节脂滴脂解和脂肪的分解［4，13］。越来越多的证据表明，肥胖增加了患肿瘤的风险，在肥胖状态下，脂肪组织或细胞分泌信号因子影响肿瘤进展，并阻碍了肿瘤的治疗［14-16］。在哺乳动物中，围脂滴蛋白家族由5 个成员组成：PLIN1、PLIN2、PLIN3、PLIN4和PLIN5。PLIN1 已被证实是脂质代谢的调节因子，PLIN1基因突变可能导致小鼠和人类严重的代谢紊乱，如脂肪营养不良、血脂异常、胰岛素抵抗型糖尿病和早熟急性冠状动脉综合征［5，17］。PLIN2已被报道为肾癌筛查和预后的生物标志物［18］，且PLIN2可以调节细胞内甘油三酯的含量和脂滴的大小，敲减PLIN2的表达可降低促动脉粥样硬化和促炎症基因的表达［19］。近年来发现PLIN3 可以调节脂滴的发生，并且发现PLIN3表达上调与肾透明细胞癌不良预后相关［20］。PLIN4 已被报道可作为化学耐药性三阴性乳腺癌的生物标记物［21］。PLIN5可通过抑制脂解维持脂质稳态，其在肝细胞癌中高表达，可以为肝细胞癌的诊断和治疗奠定基础［22］。

本研究表明PLIN3 高表达提示LUAD 临床预后较差，其表达差异与LUAD 的分级和分期密切相关。细胞实验发现，PLIN3 在肺腺癌细胞中高表达，且PLIN3 可促进肺腺癌细胞侵袭。根据数据库分析和实验发现，PLIN3的表达可作为LUAD 临床诊断的有效评价指标。然而，本研究没有进一步探讨PLIN3促进LUAD 侵袭的具体分子机制，这是本研究的局限性之一，需要未来更多实验研究来证实。