复方丹参滴丸联合依达拉奉在断肢再植后缺血再灌注损伤中的应用观察

杨晓亮 邵新中 刘宁 于亚东 于晓飞

缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion injury，IRI)是断肢再植术后血管痉挛或血栓形成的始动因素之一[1,2]，可损伤远隔器官，进一步演变为全身炎性反应综合征，甚至多器官功能衰竭，威胁患者生命安全。如何缓解肢体IRI，降低致残率、病死率已成为临床研究热点之一。相关研究表明，能量代谢障碍、钙离子超载、氧自由基释放等可能在断肢再植后IRI中发生、发展中起着关键作用[3,4]。另有学者指出，细胞凋亡是IRI的重要病理改变[5]。依达拉奉可有效抑制氧自由基对机体损伤，防止细胞凋亡，但部分断肢再植后IRI患者整体疗效不太乐观。近年来，中药凭借多靶点、多途径等优势在IRI治疗中广受临床关注。复方丹参滴丸是一种纯中药复方制剂，具有活血化瘀、理气止痛的功效，有助于提高机体抗缺氧能力、扩张冠状动脉[6,7]。但关于复方丹参滴丸联合依达拉奉对断肢再植后IRI患者凋亡蛋白水平的干预效果有待进一步商榷。基于此，本研究首次采用复方丹参滴丸联合依达拉奉治疗，探讨其对断肢再植后IRI患者氧化应激、凋亡蛋白的影响。具体分析如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2017年1月至2019年9月我院156例断肢再植后IRI患者作为研究对象，简单随机化分组，每组78例。2组基本资料[性别比、年龄、体重指数(BMI)、受伤至手术时间、手术用时、肢体缩短、受伤原因、受伤部位]差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 2组一般资料比较 n=78

1.2 纳入与排除标准

1.2.1 纳入标准：①符合断肢再植术指征者；②受伤至手术时间<8 h；③本研究均经我院医学伦理委员会批准，且患者及家属均签署知情同意书。

1.2.2 排除标准：①凝血机制紊乱或活动性出血者；②合并肝肾等重要脏器器质性病变者；③处于妊娠期、产褥期或哺乳期等特殊时期者；④既往有复方丹参滴丸、依达拉奉等药物过敏史者；⑤合并颅脑、胸腹脏器损伤者；⑥肢体软组织>肢体横断面的1/4者；⑦合并血管损伤的开放性复合伤者；⑧残留皮肤>肢体周径的1/8者；⑨合并肢体血栓闭塞性血管病变或原发性深静脉瓣膜病变者；⑩精神行为异常者。

1.3 方法 2组均实施断肢再植术，术后配合相关治疗。

1.3.1 对照组:术后静脉滴注0.5 mg/kg依达拉奉(山东新华制药股份有限公司，国药准字H20203037)加入100 ml氯化钠溶液(0.9%)，2次/d。

1.3.2 观察组:在对照组基础上口服复方丹参滴丸(天士力医药集团股份有限公司，国药准字Z10950111)治疗，250 mg/次，3次/d。2组于治疗10 d后评估相关结果。

1.4 观察指标 (1)比较2组术后断肢再植成活率及断肢血管危象发生率。(2)采用全自动血凝分析仪(型号：CS-5100，购自德国西门子公司)检测比较治疗前、治疗第3、10天凝血功能[活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶时间(TT)]。(3)比较治疗前、治疗第3、10天2组血清SOD、MDA水平。(4)比较治疗前、治疗第3、10 d 2组Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白水平。(5)统计2组不良反应(头晕头痛、皮疹、胃肠道反应)发生率。(6)采用Fugl-Meyer运动功能测评法(Fugl-Meyer Assessment of MotorFunction，FMA)[8]评估2组治疗前、治疗后6个月肢体功能，总分0～100分，其中<50分为Ⅰ级(严重运动障碍)，50～84分为Ⅱ级(明显运动障碍)，85～95分Ⅲ级(中度运动障碍)，96～99分为Ⅳ级(轻度运动障碍)。

1.5 检测方法 (1)空腹取3 ml静脉血，3 000 r/min离心10 min，分离取血清，置于-70℃冰箱低温保存，采用比色法检测血清丙二醛(MDA)水平，采用黄嘌呤氧化酶法检测血清超氧化物歧化酶(SOD)，试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司，严格按照试剂盒说明书。(2)采用免疫组化法检测Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白，兔抗人Bcl-2、Bax、Caspase-3单克隆抗体购自上海莼试生物技术有限公司，具体方法：取中性甲醛固定组织标本，制成连续切片(厚度为3 μm)。二甲苯脱蜡、梯度无水乙醇水化，柠檬酸缓冲液修复抗原，滴加过氧化氢(3.0%)1滴离去离子，水室温孵15 min，缓冲液反复冲洗3次；滴加山羊血清1滴封闭15 min，弃去血清，缓冲液冲洗1次。分别滴加Bcl-2抗体、Bax抗体、Caspase-3抗体，孵育8 h，温度控制在4℃。次日以缓冲液冲洗切片3次，后滴加生物素标记的羊抗小鼠IgM二抗，室温条件下孵育20 min，3,3′-二氨基联苯胺显色，苏木素复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，封片，显微镜下检查。

2 结果

2.1 临床疗效指标 观察组术后断肢再植成活率(97.44%)及断肢血管危象发生率(3.85%)与对照组(93.59%、2.56%)相比，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 2组临床疗效指标比较 n=78,例(%)

2.2 凝血功能 2组治疗前APTT、TT相比，差异无统计学意义(P>0.05)；组间比较，观察组治疗第3天、10天APTT、TT低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；不同时间点比较，2组APTT、TT先升高再降低，并于治疗第3天达到峰值，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 2组凝血功能指标比较

2.3 血清SOD、MDA水平 2组治疗前血清SOD、MDA水平相比，差异无统计学意义(P>0.05)；组间比较，观察组治疗第3天、10天血清SOD水平高于对照组，血清MDA水平低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；不同时间点比较，2组血清SOD水平先降低再升高、血清MDA水平先升高再降低，并均于治疗第3 d达到峰值，差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 2组血清SOD、MDA水平比较

2.4 Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白水平 2组治疗前外周血Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白相比，差异无统计学意义(P>0.05)；组间比较，观察组治疗第3天、10天外周血Bcl-2蛋白表达高于对照组，Bax、Caspase-3蛋白表达低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05；不同时间点比较，2组Bcl-2蛋白表达先降低再升高、Bax、Caspase-3蛋白表达先升高再降低，并均于治疗第3天达到峰值，差异有统计学意义(P<0.05)。见表5。

表5 2组Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白水平比较

2.5 不良反应发生率 观察组不良反应发生率(12.82%)与对照组(8.97%)对比，差异无统计学意义(P>0.05)。见表6。

2.6 肢体功能 2组治疗前肢体功能评分相比，差异无统计学意义(P>0.05)；治疗后6个月2组肢体功能评分较治疗前升高(P<0.05)；观察组治疗后6个月肢体功能评分高于对照组(P<0.05)。见表7。

表7 2组肢体功能评分比较 n=78,分,

3 讨论

文献指出，断肢再植后IRI发生是一个多因素参与、多机制损伤的过程[9]，目前临床尚未完全明确其发病机制，研究认为，其与氧自由基介导的脂质过氧化存在密切联系[10,11]。因此，减少氧自由基产生是减轻断肢再植后IRI、促进缺血肢体血液供应恢复、维持肢体存活及功能的重要环节。依达拉奉属新型自由基清除剂，通过电子直接清除羟自由基，可清除自由基，抑制细胞膜过氧化连锁反应，进而有效减轻血管内细胞氧自由基损伤[12]，但单一用药治疗效果不甚理想，可能引发血小板减少、皮疹等不良反应。

复方丹参滴丸主要由丹参、三七、冰片等成分组成，其中丹参味苦，微寒，归心、心包、肝经，可活血调经，祛瘀止痛，凉血消痈，除烦安神；三七性甘、微苦，温，归肝、胃经，能化瘀止血，活血定痛；冰片辛，苦，微寒，归心、脾、肺经，有清热止痛之功，诸药共奏祛瘀止痛的功效。戢艳琼等[13]通过136例行经皮冠脉动脉介入术治疗的急性心肌梗死患者发现，术后应用复方丹参滴丸，有助于降低术后IRI，是防治急性心肌梗死后心力衰竭、改善预后的关键。另外，杨晓亮等[14]研究显示，受炎性因子及巨噬细胞大量分泌影响，断指再植术后患者断指部位易发生血管痉挛情况，影响机体凝血及纤溶系统，随时间延长可引发缺血，增加术后手指血管危象发生风险。在此基础上，本研究针对断肢再植后IRI患者首次采用复方丹参滴丸联合依达拉奉治疗，结果显示，二者联合对断肢再植成活率及断肢血管危象发生率的影响小，有助于减少术后凝血功能异常。现代药理研究表明，三七富含三七总皂苷成分，具有显著体内外抗抑制血小板聚集、抗血栓形成作用[15]，与依达拉奉联合，利于防止凝血机制异常，降低血栓发生率。

同时，研究证实氧自由基是造成IRI的重要因素，也是IRI的重要发病环节，不仅可损伤线粒体，引发呼吸传递链功能异常，增加电子漏[16]，还能活化大量单核细胞、中性粒细胞，上调诱导型一氧化氮合酶表达，释放过量一氧化氮，进而发生锁链式反应，诱导持续损伤。MDA是自由基所致脂质过氧化终末代谢产物，其水平升高可间接反映氧自由基生成及其所致组织细胞损伤程度，体现机体氧化应激反应。SOD是反映组织内氧自由基水平及脂质过氧化程度的重要指标之一，可间接反映机体氧自由基清除能力。李倩等[17]研究显示，心肌缺血再灌注损伤发生与内源性氧自由基清除剂SOD活性下降、氧自由基MDA含量升高存在一定关系。本研究数据表明，复方丹参滴丸联合依达拉奉有助于调节断肢再植后IRI患者氧化应激，这可能是由于复方丹参滴丸中富含丹参素、维生素E及硒等成分，可增强SOD及谷胱甘肽过氧化物活性，启动内源性抗氧化反应，抑制氧化应激损伤，与依达拉奉联合可发挥良好协同作用，进一步增强SOD活性，抑制MDA释放，保护骨骼肌组织正常灌注，抑制软骨组织退行性改变，从而对断肢再植后IRI患者骨骼肌发挥良好保护作用。

另外，大量骨骼肌细胞凋亡是断肢再植后IRI最主要分子生物学变化，而Bax是一种促凋亡基因，与Bcl-2相互作用可调控细胞正常凋亡过程，二者比值改变可作为反映细胞对凋亡信号的应答的辅助指标之一[18]。Caspase-3是多条凋亡通路联系因子，可直接或间接参与凋亡蛋白产生，引发细胞凋亡，白建伟等[19]研究表明，胃癌患者细胞总凋亡率逐渐增加与线粒体凋亡通路中Bax、Caspase-3分子激活有关,可为胃癌临床化疗方案提供新的探索。同时线粒体损伤可能也是缺血再灌注诱导细胞凋亡的重要因素，而Bcl-2主要分布于线粒体膜上，不仅可维持线粒体正常功能、抑制凋亡因子外溢，还能抑制钙离子释放，发挥良好抗氧化剂作用。本研究通过对比研究可见，复方丹参滴丸联合依达拉奉调节断肢再植后IRI患者Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白水平优于依达拉奉单一治疗。分析机制在于，复方丹参滴丸中丹参酮IIA下调Fas基因及其配体FasL蛋白表达，可达到抑制细胞增殖活性、改变呈曲型细胞凋亡的目的，与依达拉奉联合，能调节Bcl-2、Bax表达平衡，抑制肢体缺血再灌注后骨骼肌细胞凋亡，减轻肢体IRI。进一步研究表明，复方丹参滴丸联合依达拉奉具有一定安全性，能有效改善断肢再植后IRI患者肢体功能，可能与机体氧化应激、细胞凋亡改善有关。