聚普瑞锌治疗大鼠缺血性结肠炎的实验研究

刘文徽， 王昌正， 马金霞， 邱海霞， 陆云龙， 王刚石， 万 军， 吴本俨， 徐世平

1.解放军总医院第二医学中心消化科 国家老年疾病临床医学研究中心，北京100853；2.解放军总医院第一医学中心激光科；3.解放军总医院海南医院病理科

缺血性结肠炎(ischemic colitis，IC)是指各种原因导致结肠供血不足而引发的肠道缺血性损伤，是最常见的肠道血管性疾病，是老年人下消化道出血最常见原因之一[1]，轻者能自行缓解，重者引发肠坏死、化脓性腹膜炎甚至危及生命。我们前期对79例住院诊治的IC患者病历资料分析显示，合并溃疡的IC患者住院时间更长[2]。目前尚无已知药物能促进缺血肠黏膜损伤的修复。聚普瑞锌(Polaprezinc，PZ)是第一个含锌元素的黏膜保护剂，由锌和L-肌钛组成的螯合物，具有黏膜保护、免疫调节、抗氧化、维持细胞稳定的作用，可促进肉芽组织再生及胃溃疡的愈合。本研究拟探索PZ对IC大鼠肠黏膜损伤的修复作用及可能机制，以期对临床上IC的防治提供有益选择。

1 材料与方法

1.1 动物Sprague-Dawley(SD)大鼠购自斯贝福生物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2016-0002。

1.2 药品与试剂PZ原料药粉末购自博大伟业制药有限公司。将PZ粉末溶于蒸馏水中,配制成3 000 mg/L药物备用。喜泊芬(5 mg/ml)购自重庆市华鼎现代生物制药有限责任公司。NF-κB p50抗体检测试剂盒和HSP70抗体检测试剂盒均购自SANTA CRUZ Biotechnology Inc (Santa Cruz, CA)。

1.3 方法

1.3.1 实验动物：雄性SD大鼠40只，体质量(200±10)g，饲养于标准环境温度(20～24 ℃)和湿度，及12 h明暗周期交替的标准动物实验室，自由饮食，并于动物适应环境1周后开始实验。

1.3.2 实验分组：40只大鼠随机分为3组：实验组(开腹+激光照射+PZ治疗)24只、对照组(开腹+激光照射)12只、空白组4只。实验组大鼠造模后每天给予3 000 mg/L PZ 3 ml，正常进食水。对照组造模后和空白组均自由饮食水。

1.3.3 光化学法建立大鼠模型：参照本实验室2007年改建并验证的光化学法建立IC大鼠模型。即使用倍频半导体激光器(波长532 nm，清华大学光电工程系研制)发射的激光照射制成IC模型。SD大鼠用质量浓度为100 g/L的水合氯醛按3 ml/kg剂量腹腔注射麻醉后，开腹找到结肠，按5 mg/kg剂量由股静脉注射喜泊芬，注射后5 min用激光照射远端结肠系膜侧的浆膜面，对周围肠管做好防激光保护。光斑直径为2.34 cm，激光输出功率550 mW，照射5 min后，硫酸庆大霉素4万单位冲洗腹腔，关腹，待大鼠麻醉清醒后送入洁净室继续喂养。

1.4 标本取材所有大鼠于术后第5天处死，处死前24 h禁食不禁水。取照射系膜对应结肠组织，立即平铺于预先置于冰上的玻璃平皿上，肉眼观察黏膜色泽、有无黏膜损伤、范围、周围黏膜情况并拍照。然后放入4%多聚甲醛中固定保存，石蜡包埋、切片、HE染色，光学显微镜(Olympus公司，日本)下观察肠黏膜病理学结果，并采用双盲法进行Chiu评分。评分标准：0分：正常肠黏膜；1分：绒毛顶端上皮下间隙扩大，伴毛细血管充血；2分：上皮下间隙进一步扩大，伴上皮层与固有层中度分离；3分：大量上皮层从绒毛两侧分离，部分绒毛顶端破坏；4分：绒毛破坏，扩张的毛细血管暴露，固有层细胞增多；5分：固有层破坏，伴出血和溃疡。

1.5 免疫组化方法检测各组大鼠结肠黏膜组织中HSP70和NF-κB p50的表达将标本常规制成石蜡切片。PBS(pH=7.4)冲洗3 min×3次，热修复2 min，滴加3%过氧化氢，室温下孵育10 min，以阻断内源性过氧化酶的活性。PBS冲洗3 min×3次，滴加稀释好的一抗(NF-κB p50稀释浓度1∶50；HSP70稀释浓度1∶300)，4 ℃过夜。PBS冲洗3 min×3次，滴加即用型Super Polymer试剂，室温下孵育10～15 min。PBS冲洗3 min×3次，滴加新鲜配制的DAB溶液，显微镜下观察3～5 min，自来水冲洗终止染色反应。苏木素轻度复染，水洗泛蓝。梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

1.6 半定量方法分析HSP70和NF-κB p50的表达

由2名高年资病理科住院医师在双盲情况下分析HSP70的免疫组化结果。随机选择10个视野。按阳性细胞在高倍镜下所占的比例分级，1级染色范围≤25%，2级染色范围>25%且≤75%，3级染色范围>75%。同时依据切片中细胞染色强度进行分级，1级无染色，2级淡染，3级深染。每个标本的2个分级相乘为最终得分，<3为阴性，≥3为阳性。

1.7 统计学分析采用SPSS 11.5 统计软件进行分析，计数资料采用χ2检验(两组比较采用卡方分割法)，等级资料采用Kruskal-Wallis检验,P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 实验大鼠的一般表现开腹手术并激光照射后全部大鼠均出现厌食、懒动、毛发卷曲无光泽等表现,并有排便次数增多以及稀便等情况。实验组24只大鼠，5只术后第1天出现便中带少许鲜血，第3天无肉眼可见血丝。对照组12只大鼠，4只术后第1天便中带少许鲜血，至第5天实验结束前仍有3只便中带血丝。空白组大鼠未见便中带血情况。

2.2 结肠黏膜大体表现实验组24只大鼠，其中4只(16.67%)结肠黏膜有肉眼可见损伤。对照组12只大鼠，其中7只(58.33%)有肉眼可见黏膜损伤，两组相比，差异有统计学意义(χ2=6.545,P=0.011)。空白组未见肉眼可见的黏膜损伤(见图1～2)。

2.3 结肠黏膜镜下及病理表现对照组大鼠部分肠黏膜表面上皮及固有腺体结构消失，可见纤维组织增生伴淋巴细胞、浆细胞浸润(见图3)。实验组大鼠肠黏膜表面上皮及固有腺体排列较规则，间质局灶见淋巴细胞、浆细胞浸润。实验组大鼠结肠黏膜炎症程度较对照组轻，实验组重度炎症占17.67%(4/24)，对照组重度炎症占75.0%(9/12)，两组比较，差异有统计学意义(P<0.05)；实验组有12.5%(3/24)的大鼠黏膜糜烂，显著低于对照组的50.0%(6/12)，两组比较，差异有统计学意义(P<0.05)；实验组有17.67%(4/24)的大鼠淋巴细胞浸润，显著低于对照组的75.0%(9/12)，两组比较，差异有统计学意义(P<0.05)；实验组有45.83%(11/24)的大鼠黏膜下层水肿，低于对照组的66.67%(8/12)，但两组比较，差异无统计学意义(P>0.05)(见表1)；对照组结肠黏膜下瘀血2例，实验组未见结肠黏膜下瘀血。

图1 激光照射大鼠结肠系膜侧浆膜面；图2 对照组黏膜充血、糜烂，实验组黏膜愈合好;图3 大鼠结肠黏膜病理图片(HE染色，放大200倍) A：对照组：大鼠肠黏膜糜烂；B：实验组：大鼠肠黏膜轻度炎症

表1 各组大鼠结肠黏膜组织镜下观察指标比较[例数(%)]

2.4 大鼠结肠黏膜组织损伤程度分析实验组结肠黏膜损伤程度分布以0分和1分为主，对照组则以2～4分为主(见表2)。实验组肠损伤Chiu评分(1.125±1.262)分显著低于对照组(2.750±1.138)分，差异有统计学意义(P=0.001)。

2.5 大鼠结肠组织HSP70和NF-κB p50表达情况分析实验组大鼠结肠黏膜HSP70表达显著高于对照组，差异有统计学意义；实验组大鼠结肠黏膜NF-κB p50表达显著低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05，见表3、图4～5)。

表2 各组大鼠结肠黏膜组织损伤程度分布Tab 2 The degree of colonic mucosal tissue injurydistributed in each group

表3 各组大鼠结肠组织HSP70 和NF-κB p50表达情况比较Tab 3 Comparison of HSP70 and NF-κB p50 expressions in colon tissues of rats in each group

注：A：实验组；B：对照组。图4 大鼠结肠黏膜HSP70表达(放大200倍);图5 大鼠结肠黏膜NF-κB p50表达(放大200倍)Fig 4 Expression of HSP70 in colonic mucosa; Fig 5 Expression of NF-κB p50 in colonic mucosa

3 讨论

IC是最常见的肠道缺血性疾病。有研究报道[3-5],我国90%的IC发生在60岁以上的老年人，常伴有高血压、冠心病、糖尿病、高脂血症、心律失常、动脉粥样硬化等基础疾病，而且对症状反应不敏感，IC又有症状重、体征轻的特点，部分患者可能发展成重型伴发肠坏死等严重并发症甚至死亡，严重威胁老年人群的身体健康。国外学者曾应用不同的方法建立了一些IC动物模型，如使用套圈来制造肠梗阻并结扎部分血管来造模[6-7]、一过性血管夹闭法造模[8]。但在后来的临床实践中发现，大部分的IC患者并未发现肠道大血管病变的证据，更多的是肠道微循环血流的受损。而光动力疗法恰是在受激光照射的小血管内形成血栓，符合大部分IC发病机制。早在2006年，我们研究团队用光动力疗法成功制成大鼠IC模型，并在此基础上展开一系列实验研究[9]。

PZ作为有效的抗溃疡药物在日本临床已经应用20余年，它由23%锌和77% L-肌钛鳌合而成，其药效主要归因于锌离子。锌是身体必需微量元素之一，在不同生物系统和生理过程中发挥至关重要的作用。如治愈创伤、促进细胞形成生长和代谢、稳定细胞膜、维护正常糖代谢和脂代谢，同时也是DNA和RNA聚合酶依赖的元素，以及维持正常的酒精代谢，锌元素通过上述功能影响细胞增殖和蛋白质合成。PZ的黏膜保护作用机制包括刺激黏液生成、抗氧化活性、膜稳定作用及诱导HSP70等。

2007年发表在Gut上的一篇文章[10]显示，PZ能促进细胞迁移和增殖，保护吲哚美辛造成的大鼠胃损伤及小鼠小肠损伤；Watari等[11]研究选用因心脑血管疾病服用小剂量阿司匹林的患者为研究对象，服用PZ前后应用胶囊内镜进行小肠病变评估，结果提示PZ能减轻低剂量阿司匹林导致的小肠黏膜损伤；Itagaki等[12]对28例活动性溃疡性结肠炎患者研究显示，应用PZ直肠内给药，PZ灌肠组的直肠、乙状结肠及降结肠的炎症内镜评分较基线水平显著改善，提示PZ能有效促进活动性溃疡性结肠炎的黏膜愈合；国内钱家鸣教授团队研究[13]显示，PZ保护乙醇所致大鼠胃黏膜损伤。本研究显示，大鼠造模后，治疗组结肠黏膜肉眼可见的损伤数目显著低于对照组；显微镜下观察，治疗组结肠黏膜重度炎症、糜烂及淋巴细胞浸润均显著低于对照组；治疗组肠黏膜损伤评分显著更低。提示PZ有效促进了结肠黏膜损伤的修复。

Odashima等[14]报道，大鼠直肠内给予PZ后应用5%乙酸灌肠，24 h后评估发现结肠黏膜损伤受到保护，结肠黏膜HSP72的表达升高，而NF-κB的活性受到抑制。在三硝基苯磺酸诱导的大鼠结肠炎模型中，PZ直肠内给药，抑制了钙调磷酸酶活化及白介素2等促炎细胞因子的表达，加速结肠炎症恢复[15]。

HSP70是热休克蛋白家族中主要成员之一，在胃黏膜和结肠黏膜中充当分子伴侣发挥重要的细胞保护作用。HSP70分子具有伴侣功能的主要原因基于其与ATP的亲和性，其与变性蛋白多肽结合后，依赖ATP水解释放出能量来解开多肽链的错误折叠，使其再次成熟为细胞内的正常蛋白，进而使细胞功能和结构得到恢复[16]。同时它又可以作为内源性保护物质对脏器损伤产生自身保护作用[17]。国内钱家鸣教授团队等[13]报道显示，PZ保护无水乙醇所致大鼠胃黏膜损伤，主要机制是通过促进胃黏膜HSP70表达。PZ通过诱导大鼠HSP70保护小肠上皮细胞免受水杨酸制剂引发的细胞毒性[18]。PZ通过上调结肠上皮细胞内HSP27和HSP72表达有效治疗过氧化氢诱发的结肠黏膜损伤[19]。本组研究显示，PZ治疗组IC大鼠结肠黏膜HSP70表达显著高于对照组，PZ可能是通过诱导大鼠结肠黏膜HSP70表达加速黏膜愈合。

NF-κB p50是一个转录调节因子，其活化能调节许多促炎因子如TNF-α、IL-1β、IL-8的转录，故在炎症中扮演重要作用。Shimada等[20]报道,L-肌钛锌能够抑制胃上皮细胞NF-κB的活性。另有研究[21]报道,HSP72通过稳定钙调磷酸酶阻止其磷酸化来降低NF-κB的活性。我们的研究同样显示，PZ治疗组大鼠NF-κB p50表达显著低于模型组，分析原因可能是大鼠结肠黏膜促进了HSP70表达，降低了NF-κB p50表达，进而抑制了其活性。

本研究实验组大鼠给予经口饮用PZ药液，未选择灌肠途径给药，是考虑到实验研究的靶器官在肠道，如果每天灌肠给药不可避免会带来肠黏膜损伤而影响实验结果评估。而且，无论是经灌肠还是灌胃途径给药均会给大鼠增加外源性刺激，使大鼠处于应激状态，也可能会影响实验结果。

综上所述，PZ能够减轻IC模型大鼠结肠黏膜炎症及糜烂，从而促进肠黏膜损伤的修复。这可能是通过诱导缺血性损伤的肠黏膜上调HSP70表达，降低NF-κB p50表达进而抑制其活性有关。上述结果为黏膜保护剂PZ对IC患者临床应用提供实验依据，期待PZ能成为临床IC防治的选择药物。