白藜芦醇预处理对老龄大鼠反复七氟烷麻醉致神经认知障碍的影响

谭兰兰，朱小芳，李 坤，胡小冬，陈世彪

(1.南昌大学a.研究生院医学部2017级; b.第一附属医院麻醉科,南昌330006；2.新余市人民医院麻醉科； 3.新余市矿业医院麻醉科,江西 新余 338000)

围术期神经认知障碍(PND)是老年患者围术期最常见的神经系统并发症之一。短期内多次经历麻醉手术，如烧伤、整容及需通过多次外科手术治疗的患者。七氟烷为临床上当前常用的吸入麻醉药，而短期内多次行七氟烷吸入麻醉可以诱发老龄大鼠神经认知障碍[1-2]。白藜芦醇是一种普遍存在于葡萄等自然界植物中具有生物活性的天然物质，其可通过抗炎、抗氧化能力及抗凋亡效用起到一定的神经系统保护功能[3]。体外试验[4]显示，白藜芦醇可以改善七氟烷麻醉诱发的神经元损伤；在体研究[5]证明，白藜芦醇可以改善异氟烷麻醉诱发的老龄小鼠中枢神经认知障碍。本研究拟评估白藜芦醇预处理对老龄大鼠短期多次七氟烷麻醉诱发神经认知障碍的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

白藜芦醇购自于西安Oasis生物技术工程有限公司(批号：20040801，纯度≥98%)，七氟醚购自于上海恒瑞医药有限公司(批号：H20070172)，1%羟甲基纤维素钠购自于湘潭嘉叶源生物有限公司，麻醉气体监测机器购自于美国Ohmeda-Detax公司。

1.2 实验动物与分组

本实验在南昌大学第一附属医院烧伤研究所完成。健康清洁级老龄雄性SD大鼠60只，体重310～460 g，月龄18个月，购自于南昌大学动科部。将实验动物随机分为对照组(C组，n=20)、七氟烷组(S组，n=20)和白藜芦醇预处理组(R组，n=20)。

1.3 麻醉模型的建立及给药

参照文献[2]，建立老龄大鼠短期多次七氟烷吸入麻醉模型。将老龄大鼠安置于密闭麻醉实验箱中，麻醉实验箱两端分别开有一小圆孔，一孔连接麻醉机，输入氧气2.5 L·min-1及氮气6 L·min-1。另一孔为排气端，且接S/5型麻醉气体监测机器(Ohmeda-Detax公司，美国)监测七氟烷、氮气及二氧化碳浓度。麻醉实验箱底部置于37 ℃的恒温水浴实验箱中。先予3组不同的预处理方式，R组在首次吸入七氟烷气体前连续7 d每天经口灌胃1%羟甲基纤维素钠溶液制备的白藜芦醇混悬液40 mg·kg-1·d-1；S组于首次吸入七氟烷气体前连续7 d每天经口灌胃等容量的1%羟甲基纤维素钠溶液40 mg·kg-1·d-1；C组在首次吸入空气前连续7 d每天经口灌胃等容量的1%羟甲基纤维素钠溶液40 mg·kg-1·d-1。预处理结束后R和S组均吸入3%七氟醚气体，C组仅吸入空气，100 min·d-1，连续吸入5 d。

1.4 标本采集及指标检测

末次吸入结束后每组随机选取10只麻醉状态下老龄大鼠，剥离颅内双侧海马组织，称重后，按体重与体积比加入4 ℃生理盐水制备成10%的组织匀浆液，低温下2500 r·min-1，离心10 min，离心半径13.5 cm，选取上清液，4 ℃低温保存下待测。测定其中超氧化物岐化酶(SOD)活性、微量丙二醛(MDA)含量和IL-1β含量。

1.5 行为学实验

末次吸入气体结束后24 h 3组取剩下的10只老龄大鼠进行Morris水迷宫实验[6]测试其认知功能。训练实验步骤：水迷宫装置为一直径150 cm，高50 cm的开口圆桶，桶内装水，水温20～24 ℃，水深40 cm。该水迷宫分设4个象限，将一直径10 cm的平台隐藏放置于一象限水面下方2 cm处。将老龄大鼠各自从各个象限面朝池壁缓慢放入水中，记录大鼠从放入水中到爬上隐藏平台所需时间(即为逃避潜伏期)。如果120 s大鼠未能找到平台，用导向杆引导大鼠至隐藏平台上，逃避潜伏期则记为120 s。每天重复训练4次，连续进行训练4 d。探索实验步骤：第5天时将隐藏平台拆除，从原平台放置的对角方向将老龄大鼠面朝池壁缓慢放入水中，记录其60 s内其在原放置隐藏平台位置停留时间，反复进行4次，取其平均值。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 水迷宫实验结果

与C组比较，S组七氟烷吸入麻醉结束后第1—4 d逃避潜伏期明显延长，原隐藏平台位置停留时间明显缩短(P<0.05)，R组逃避潜伏期和原隐藏平台位置停留时间差异则无统计学意义(P>0.05)；与S组比较，R组第1～4 d逃避潜伏期明显缩短，原隐藏平台位置停留时间明显延长(P<0.05)。见表1。

表1 3组大鼠Morris水迷宫实验结果比较

2.2 海马SOD活性、IL-1β和MDA含量的比较

与C组比较，S组七氟烷吸入麻醉结束后即刻海马SOD活性明显下降，MDA含量和IL-1β含量明显升高(P<0.05)，R组海马SOD活性、MDA含量和IL-1β含量差异则无统计学意义(P>0.05)；与S组比较，R组老龄大鼠海马SOD活性明显升高、MDA含量和IL-1β含量明显降低(P<0.05)。见表2。

表2 3组大鼠海马SOD活性、IL-1β和MDA含量的比较

3 讨论

老年因素是致使围术期神经认知障碍的最重要因素之一[7]。月龄为18个月的大鼠相当于大于65岁的老年人，因此本研究选取18个月大鼠作为本实验动物，并依据文献[2]采取循环密闭式麻醉实验箱方法制备老龄大鼠短期多次七氟烷吸入麻醉模型，本实验成功制备短期多次七氟烷麻醉诱发的老龄大鼠神经认知障碍模型。

有研究[8]表明，短期多次吸入3%七氟烷可诱发老龄大鼠围术期内神经认知障碍，本实验采取吸入3%浓度七氟烷气体，100 min·d-1，连续吸入5 d。Morris水迷宫实验方式被认为是研究啮齿动物空间学习及记忆功能的经典方法，常被广泛用于测试大鼠学习及记忆能力，该实验所获得的逃避潜伏期时间及反复跨越平台次数两个指标，不仅可以客观地反映动物的空间认知能力，而且还可有效评估某些药物干预后对该实验动物学习记忆能力的动态变化[9]。本实验依据文献[4]采用该实验方式测试大鼠麻醉后的认知功能，结果显示，与C组比较，S组大鼠短期多次七氟烷吸入麻醉后其逃避潜伏期延长、原隐藏平台放置位置停留时间明显缩短(P<0.05)；多起多次吸入七氟烷可导致大鼠神经认知损害的发生，而由白藜芦醇预处理之后可以有效改善大鼠神经认知障碍。

中枢性炎性因子表达的增多与认知功能的损害密切相关，IL-1β是被重点关注的促炎细胞因子，它不仅能够减少海马神经元生长来源，其升高还能够增加神经细胞的凋亡进程，导致中枢神经系统性疾病的发生[10]。CAO等[11]研究显示，在神经认知障碍的发生发展过程中，免疫系统会被大范围激活，海马内固有的星型胶质细胞活化，最终促使促炎因子IL-1β表达上调。而本实验研究结果与此观点类似，提示短期多次七氟烷吸入麻醉后诱导的大鼠神经认知障碍发生与炎症因子产生高度相关。

SOD作为一种活性物质，可以清除自由基等有害产物，使大脑免遭氧化应激造成的损伤，起到一定的脑保护作用，是机体细胞内天然存在的抗氧化剂，也是实验中常用来代表机体内氧化应激水平的重要指标。MDA是脂质过氧化反应后的主要代谢性产物，其含量对氧化应激的动态变化较为敏感，能很好地反映机体氧化应激损伤造成的严重程度[12]。本研究结果显示，短期多次七氟烷吸入麻醉可使大鼠体内氧自由基清除能力减弱，降低其抗氧化能力，造成体内氧化自由基堆积，而白藜芦醇预处理可以有效改善这些损害。

以往临床研究[13]证明，七氟烷吸入复合麻醉围术期，老年患者的认知功能出现短期障碍。烧伤及创伤外科老年患者常需进行短期多次手术和麻醉，短期多次七氟烷麻醉对老年患者的认知损害程度可能更甚。本实验结果显示，短期多次吸入七氟烷可诱使老龄大鼠短期神经认知障碍，但与C组比较，R组大鼠逃避潜伏期时间、原隐藏平台位置停留时间、海马IL-1β含量、SOD活性和MDA含量差异无统计学意义(P>0.05)，提示白藜芦醇预处理可改善甚至逆转老龄大鼠短期多次七氟烷麻醉造成的神经认知障碍。林茂等[14]学者证实,白藜芦醇能较好地改善阿尔茨海默症小鼠认知功能损害。本实验对象是七氟烷麻醉后大鼠，也得出类似结果，均提示白藜芦醇具有改善神经认知损害的作用。

综上所述，白藜芦醇预处理可以改善短期多次七氟烷吸入麻醉致老龄大鼠神经认知障碍，其机制可能与白藜芦醇改善大鼠颅脑组织抗氧化效能及抑制海马炎性瀑布反应有关。