HPLC法测定盐酸莫西沙星片中光降解杂质的含量

李林梅，宋太发，索成林，胡雄，唐娟丽，李帅帅

(湖南天济草堂制药股份有限公司，湖南 长沙，410205)

盐酸莫西沙星由德国拜耳公司于20世纪90年代末期开发上市的第4代广谱氟喹诺酮类抗菌药，自1999年以来已在多个国家上市，盐酸莫西沙星片于2002年在中国批准上市，上市剂型有片剂、小容量注射剂及大容量注射剂。

朱荣等[1-2]采用梯度洗脱的方法，对盐酸莫西沙星含量和有关物质的检测方法进行了研究，其中包括杂质A～E。苏敏等[3]采用等度洗脱，通过流动相比例优化，实现了盐酸莫西沙星葡萄糖溶液中杂质A～E的分离检测。高宏伟等[4-5]也采用高效液相色谱法，对盐酸莫西沙星杂质进行了分析。董雅等[6]对莫西沙星有关物质研究的相关文献进行了综述报道，文章指出目前针对莫西沙星有关物质的控制，大多仅研究了杂质A～E。郑家晴等[7]报道了A～F的有关物质分析方法。

2012年，URSZULA等[8]报道了莫西沙星在紫外照射条件下，以及有无Cu(Ⅱ)，Zn(Ⅱ)，Al(Ⅲ)和Fe(Ⅲ)等离子的溶液和固体中，莫西沙星会发生光降解，其中2’-氧代莫西沙星为光降解杂质之一。本文结合盐酸莫西沙星的生产工艺路线，针对6个杂质，分别为1-环丙基-6,7-二氟-1,4-二氢-8-羟基-4-氧代-3-喹啉羧酸(杂质K，中间体降解产物)、1-环丙基-6,7-二氟-1,4-二氢-8-甲氧基-4-氧代-3-喹啉羧酸乙酯(杂质L，工艺杂质)、6-羟基莫西沙星(杂质N，工艺杂质)、2’-氧代莫西沙星(杂质M，文献报道的光降解杂质)、加替沙星中间体(母核，合成莫西沙星的关键物料)、1-环丙基-6,7-二氟-1,4-二氢-8-甲氧基-4-氧代-3-喹啉羧酸-(O3,O4)-双-(乙酰氧基)-硼酸酯(中间体，工艺杂质)，进行有关物质分析方法开发。同时杂质A～F在该方法下进行了专属性研究，排除杂质A～F不会干扰这6个杂质的检出。

对各国收录的盐酸莫西沙星片标准比较，发现其有关物质检测方法大多采用苯基柱。本文优化了有关物质检测方法，采用常用的C18柱和等度洗脱的方法，可有效分离上述6个杂质。同时对方法进行验证，结果显示：此方法专属性好，操作简便，对多个杂质均能有效分离，可作为有关物质检查方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Ultimate 3000高效液相色谱仪(Thermo Fisher Scientific公司)，EX125DZH型电子天平(OHAUS公司，精密度1/100 000)。

盐酸莫西沙星片,批号190301，190302(湖南天济草堂制药股份有限公司)；杂质A,批号151023(北京康派森医药科技有限公司，含量99.4%)；杂质B,批号33266(北京康派森医药科技有限公司，含量99.2%)；杂质C，批号34835(北京康派森医药科技有限公司，含量99.4%)；杂质D，批号27546(北京康派森医药科技有限公司，含量99.6%)；杂质E，批号39081(北京康派森医药科技有限公司，含量98.3%)；杂质F，批号25520(北京康派森医药科技有限公司，含量99.9%)；杂质N，批号MX-190422(深圳博泰尔生物技术有限公司，含量96.1%)；中间体，批号39065(北京康派森医药科技有限公司，含量99.9%)；杂质M，批号2798-072A3(TLC，含量99.4%)；杂质L，批号19-MVI-71-2(TRC，含量98.0%)；杂质K，批号MXJ20111201(北京康派森医药科技有限公司，含量99.3%)；母核，批号MXG20111201(北京康派森医药科技有限公司，含量98.4%)；盐酸莫西沙星对照品，批号3.0(EP，含量96.9%)；甲醇、乙腈为色谱纯，水为超纯水(Millipore公司)，其余试剂均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件

采用高级液相色谱法(HPLC)进行检测，色谱条件为：色谱柱为Agilent poroshell EC-C18柱(5.0 μm，4.6 mm×250 mm，Agilent公司)；四丁基硫酸氢铵缓冲液∶甲醇(90∶10)(V/V)为流动相A；甲醇∶四丁基硫酸氢铵缓冲液(90∶10)(V/V)为流动相B；流动相为A稀释溶剂；采用等度洗脱，检测波长为247 nm；柱温30 ℃；进样体积20 μL；流速1.3 mL/min。

1.2.2 杂质结构

盐酸莫西沙星涉及的6个杂质，结构见图1。

图1 盐酸莫西沙星6个杂质结构Fig.1 The six impurity Structrue of Moxifloxacin hydrochloride

1.2.3 专属性

杂质定位溶液制备：精密称取A～F等各杂质适量，制成100 μg/mL的各杂质贮备液；精密移取1 mL各杂质贮备液，分别置100 mL量瓶中，稀释定容，制成1.0 μg/mL的单个杂质定位溶液。

1.2.4 系统适用性溶液制备

精密称取杂质K，L，M，N，中间体和母核等各杂质适量，制成100 μg/mL的单个杂质贮备液。精密移取1 mL各杂质贮备液，置同一100 mL量瓶中，稀释定容，制成终质量浓度约为1.0 μg/mL的杂质混合溶液；另精密称取盐酸莫西沙星对照品适量，置10 mL量瓶中，加杂质混合溶液稀释并定容至刻度，制成各杂质质量浓度为1 μg/mL、莫西沙星约为1.0 mg/mL的系统适用性溶液。

1.2.5 系统适用性试验

将系统适用性溶液连续进样6次，进样体积20 μL，系统适用性要求：主峰莫西沙星与相邻杂质，以及各杂质之间的分离度均不得小于1.5，主峰理论板数不得小于20 000；杂质峰面积的相对标准偏差(relative standard deviation，RSD)均不得小于2.0%，保留时间的RSD均不得小于1.0%(n=6)。

1.2.6 供试品溶液的制备

精密称取盐酸莫西沙星片适量(相当于莫西沙星50 mg)，置50 mL量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，得1.0 mg/mL的供试品溶液。

2 结果

2.1 方法专属性

空白溶剂、各杂质定位溶液、系统适用性溶液等样品溶液，进样体积20 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，各杂质不干扰2’-氧代莫西沙星的测定，试验结果见表1，相关图谱见图2和图3。

表1 方法专属性结果Table 1 Resuit of method specificity

图2 空白溶剂图谱Fig.2 Chromatogram of blank solution

图3 系统适用性溶液图谱Fig.3 Chromatogram of system suitability solution

2.2 进样精密度

按所述色谱条件试验，精密量取系统适用性溶液20 μL，注入色谱仪，记录色谱图，重复进样6次。2’-氧代莫西沙星峰保留时间RSD为0.10%；峰面积RSD为1.18%，说明仪器精密度良好。

2.3 定量限与检测限

同2.2项操作，精密量取2’-氧代莫西沙星(杂质M)对照贮备液适量，用稀释剂逐级稀释，分别注入色谱仪，当信噪比为10∶1时，得定量限(LOQ)，连续进样6次，记录色谱图。当信噪比为3∶1时，得检测限(LOD)，连续进样3次，记录色谱图，定量限为3.021 ng，RSD%(n=6)4.56%，检测限为1.510 ng。

2.4 线性与范围

精密量取2’-氧代莫西沙星(杂质M)对照贮备液适量，稀释成0.015 1，0.201 0，0.503 0，0.806 0，1.007 0和2.517 0 μg/mL的系列质量浓度线性溶液，各质量浓度进样20 μL，以2’-氧代莫西沙星的质量浓度与峰面积之比进行线性回归。得回归方法：y=0.297x-0.016(r=0.999 5)，线性范围为0.151～2.517 μg/mL，定量下限为0.151 μg/mL。

2.5 溶液稳定性

取2.3项下2’-氧代莫西沙星(杂质M)对照贮备液适量，稀释制成终质量浓度为1.0 μg/mL的对照品溶液，室温放置，分别于0，4，12，14，16，18和20 h精密量取20 μL，测定峰面积，峰面积RSD(n=6)为1.17%，小于5%，说明对照品溶液室温0～20 h内稳定。

2.6 重复性

取盐酸莫西沙星适量，用稀释剂溶解并稀释制成每1 mL中约含1 mg的溶液，平行配制6份，按照2’-氧代莫西沙星检测方法测定，6份供试品中均未检出2’-氧代莫西沙星，结合回收率结果，该法重复性良好。

2.7 回收率

配制低、中、高3个质量浓度2’-氧代莫西沙星(5.04，10.12和15.03 μg/mL)标准系列样品各3份，进样20 μL，记录2’-氧代莫西沙星的峰面积。按照2.3项下新配制2’-氧代莫西沙星对照品溶液，终质量浓度为1.0 μg/mL，进样20 μL，记录对照峰面积。2’-氧代莫西沙星3个质量浓度水平的回收率为97.7%,98.5%和99.7%，平均回收率98.6%，RSD(n=9)为1.51%，结果见表2。

表2 2’-氧代莫西沙星回收率结果(n=9)Table 2 Recovery results of 2’-oxymoxifloxacin in moxifloxacin hydrochloride (n=9)

3 讨论

目前未见相关文献报道盐酸莫西沙星片中光降解杂质2’-氧代莫西沙星的测定方法，本文建立的HPLC方法，不仅能有效分离多个杂质，同时能有效检测2’-氧代莫西沙星，专属性良好。在建立本定量分析方法时，对流动相比例、检测波长、流速、柱温等分析方法进行了筛选优化，改善了各杂质的分离度，最终确定本文采用的色谱条件。

采用Agilent Poroshell EC-C18色谱柱，固定柱温35 ℃，流速1.3 mL/min，检测波长设为293 nm[1](293 nm为莫西沙星的最大吸收波长)，通过调整流动相A相和B相的比例进行检测方法的优化。当流动相比例为60∶40(V/V)时，运行时间60 min内杂质K，L，M，中间体和母核5个杂质未完全分离，其中2个杂质相互重叠为一个峰；当调整流动相比例至(50∶50)(V/V)时，运行时间35 min内5个杂质均能有效分离，最小分离度为1.45，各峰峰行良好。但该检测条件，杂质N未出峰。

鉴于杂质N未出峰，通过对单个杂质溶液、混合杂质溶液的紫外吸收波长扫描分析，最终选用247 nm作为该方法的检测波长。固定流动相比例至50∶50(V/V)，在247 nm进行HPLC分析，结果显示：杂质K，L，M，N，中间体和母核6个杂质与主峰全部实现有效分离，最小分离度为2.97，各峰峰行良好。

将流速设为1.0 mL/min，杂质K，L，M，N，中间体和母核6个杂质全部有效分离，最小分离度达1.81，各峰峰行良好，说明流速的调整，对分离效果影响不大。

将波长设为247 nm，柱温设为30 ℃，杂质K，L，M，N，中间体和母核6个杂质全部有效分离，最小分离度达3.21，各峰峰行良好，说明降低柱温，可提高分离效果。

综上，采用Agilent Poroshell EC-C18色谱柱，四丁基硫酸氢铵缓冲液∶甲醇(90∶10)(V/V)为流动相A；甲醇∶四丁基硫酸氢铵缓冲液(90∶10)(V/V)为流动相B；流动相A为稀释溶剂；采用等度洗脱，检测波长为247 nm；柱温30 ℃；进样体积20 μL；流速1.3 mL/min。参照相关文献[9-10]报道的验证思路，结果表明：本文研究方法专属性好，灵敏度满足检测要求，可作为新的分析方法，用于盐酸莫西沙星片多个杂质的研究。