水曲柳促生蜡样芽胞杆菌SQL0164的分离鉴定及其根表定殖分析

（东北林业大学 a.生命科学学院；b.林木遗传育种国家重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150040）

植物促生根细菌（Plant growth-promoting rhizobacteria，简称PGPR）是指栖居于植物根组织内部、表面以及根际土壤中，能够促进植物生长或者防治植物病害的一类有益细菌的统称[1]。近年来，植物促生根细菌已被广泛应用于农业生产与绿化造林中。Dey 等[2]研究发现，从花生根际分离得到的9 株促生细菌能够通过改善花生对养分的吸收提高其产量。Thakur 等[3]研究发现，从茶树根际分离的菌株Viridibacillus arenosiIHB B 7171 通过产生吲哚乙酸、分泌ACC 脱氨酶等刺激调节茶树的生长。

PGPR 促进寄主植物生长的作用机制主要包括以下几个方面：1）产生植物生长调节物质，促进寄主生长[4]；2）生物固氮、解磷、产生嗜铁素等物质，促进寄主植物对养分的吸收[5]；3）产生抑菌化合物抑制病原菌的生长，诱导植物产生对病原菌的抗性，提高寄主的健康水平[6]。其中在寄主植物上稳定的定殖是PGPR 发挥其有益功能的重要前提。Anto 等[7]研究表明，瓦雷兹芽胞杆菌FZB42 能通过有效定殖于莴苣来促进其生长，但它的nfrA-突变体的定殖能力显著下降，并且不再具有促生能力。另外，Beauregard 等[8]研究表明，细菌的粘附性以及运动能力是影响其在寄主植物上定殖效率的关键因素。目前，PGPR 在寄主植物上定殖的机理研究主要集中于草本植物，特别是农作物，而关于PGPR 在木本植物上定殖的研究则鲜有报道。

水曲柳Fraxinus mandshurica与胡桃楸、黄菠萝并称为“东北三大硬阔”，是珍贵的用材树种，具有适应性强、用途广泛等特点[9]。近年来，由于过度砍伐，水曲柳数量日益减少，已被确定为国家渐危三级保护树种，因此，亟需通过人工造林增加水曲柳数量，保障相关产业的木材供给。水曲柳是较为喜水肥的树种，土壤肥力不足将影响水曲柳幼树的生长，目前，在苗圃育苗时，主要通过施加氮、磷等化肥来满足水曲柳幼苗生长的需求[10]，但化学肥料的肥效持久度不高，幼苗移栽后，肥效几乎丧失，且化学肥料的过度施用，不但会对环境造成负担，而且还会导致土壤中的有机质加速消耗[11]。本研究从苗期水曲柳植株的根系分离获得一株能够显著促进水曲柳生长的蜡样芽胞杆菌SQL0164，并对其在水曲柳根部的定殖动态及定殖相关的生物学性状进行了分析，取得的研究结果将为揭示芽胞杆菌在水曲柳根部定殖的机制奠定理论基础，同时为水曲柳促生芽胞杆菌生物制剂的开发与高效应用提供理论指导。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 培养基

0.1×TSA（Tryptone soya agar）平板：1.5 g/L胰蛋白胨，0.5 g/L 大豆蛋白胨，0.5 g/L NaCl，15 g/L琼脂，pH 值7.3±0.2，121℃，20 min。

LNM（Low nutrient medium）平板：（配制母液：0.5 g/L MgSO4，0.5 g/L KNO3，1.3 g/L K2HPO4，0.06 g/L Ca(NO3)2，2.5 g/L glucose，0.2 g/L 水 解酪蛋白），过滤灭菌；将母液稀释100 倍，加入15 g/L 琼脂。

TSB（Tryptic soy broth）：15 g/L 胰蛋白胨，5 g/L 大豆蛋白胨，5 g/L NaCl，121℃，20 min。

TSBG（Tryptic soy broth glucose）：TSB 加1%Glucose，过滤灭菌。

LB（Luria bertani）：10 g/L 胰蛋白胨，10 g/L NaCl，5 g/L 酵母提取物。

LBG（Luria bertani glucose）：LB 加1%Glucose，过滤灭菌。

LBGM（Luria bertani glycerol MnCl2）：LB添加1% glycerol 和100 μmol MnCl2，过滤灭菌。

NB（Nutrient broth）：3 g/L 牛肉膏，10 g/L蛋白胨，5 g/L NaCl，121 ℃，20 min。

Swimming motility 平板：10 g/L 胰蛋白胨，10 g/L NaCl，2 g/L 琼脂，5 g/L 酵母提取物。

Swarming motility 平板：10 g/L 胰蛋白胨，10 g/L NaCl，7 g/L 琼脂，5 g/L 酵母提取物。

MSGG（Msgg broth）培养基配方见文献[12]。

1.1.2 供试细菌菌株

菌株SQL0164：分离自水曲柳根部细菌。

菌株AB7：BacillusvelezensisFZB42（degU）运动缺陷型突变体。

1.2 菌株的分离、纯化及保存

1.2.1 土壤与水曲柳根系取样

选取温室栽培的3年生水曲柳植株用于样品采集，取表层1 cm 以下，距离植物3～5 cm 的土壤5 g，用作外周土壤样品；切取水曲柳侧根，抖落与侧根疏松结合的土壤，将根系样品放入50 mL盛有PBS 缓冲液的无菌Falcon 管中，并置入玻璃珠若干，在漩涡振荡器上震荡15 min 后，用无菌镊子取出根系，转入新的50 mL 无菌Falcon 管中，用作根系样品；吸取1 mL 土壤悬浮液转入无菌的1.5 mL 离心管中，用作根际土壤样品。

1.2.2 水曲柳根系、根际土壤及外周土壤样品细菌的分离与纯化

称重后，在盛有无菌PBS 缓冲液与无菌石英砂的研钵中将根系样品研碎，混匀后制成悬浮液；取1 mL 根际土壤样品与9 mL 无菌PBS 缓冲液混合，混匀后制成悬浮液；将1 g 外周土壤样品加入10 mL 无菌PBS 缓冲液中，混匀后制成悬浮液。将上述悬浮液样品分别梯度稀释至10-9，吸取合适的3 个梯度稀释液100 μL 涂平板，重复3 次，置于30 ℃培养48 h，培养结束后，挑取单菌落纯化并保存于87%甘油中，置于-80 ℃。

1.3 水曲柳促生细菌的筛选

1.3.1 菌悬液的配制

将以上分离获得的菌株活化、摇培，并用生理盐水稀释至105CFU/mL。

1.3.2 水曲柳促生细菌的筛选

将水曲柳种子播于培养基质（营养土体积∶蛭石体积=3∶1，121 ℃灭菌30 min）中，使植物在光照15 h、温度（24±2）℃与湿度60%～80%的条件下生长一周，待大部分幼苗子叶张开时，选取长势一致的植株，将5 mL 菌悬液浇灌于根部，每个菌株浇灌20 棵幼苗，对照植株浇灌5 mL 生理盐水，处理后三周调查水曲柳幼苗的鲜质量与株高等生理指标，该实验重复5 次。

1.4 菌株SQL0164 的分类鉴定

1.4.1 形态观察

将菌株SQL0164 在0.1×TSA 平板上培养24 h后，观察并记录其形态特征。生理生化实验参照文献[13]。

1.4.2 菌株SQL0164 的16S rRNA 基因序列系统发育分析

以SQL0164 的基因组DNA 为模板，采用引物 为27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-GGTTACCTT GTTACGACTT-3′），参照文献[14]扩增16S rRNA 基因，将PCR 产物送至擎科生物科技有限公司测序，结果提交至NCBI 数据库进行BLAST 比对，采用MEGA6.0软件构建系统发育进化树。

1.5 菌株SQL0164 在水曲柳根表定殖的检测

1.5.1 水曲柳组培苗的培养及菌株SQL0164 的接种

水曲柳组培苗培养于0.6%（wt/vol）琼脂固化的无蔗糖MS 培养基中，24 ℃，光照时间16 h。活化并于液体LB 培养基中摇培菌株SQL0164，待OD600达到1.0（108CFU/mL-1），以1×PBS 稀释1 000 倍制成菌悬液。生长7 d 的水曲柳组培苗根系浸泡于菌悬浮液中1 h 后，将组培苗转移至0.6%琼脂固化的无蔗糖MS 培养基上培养。

1.5.2 菌株SQL0164 在水曲柳根表定殖量的检测

分别于接种菌株SQL0164后的第0天、第5天、第10 天及第15 天，切取水曲柳根组织，转移至离心管中，称量并记录根质量。向离心管中加入1 mL 1×PBS 和玻璃珠若干，依次超声震荡1 min，漩涡震荡1 min，冰浴1 min，重复3 次。将获得的菌悬液梯度稀释10～108倍，吸取10 μL 菌悬液涂布于LB 平板，30 ℃培养24～48 h，记录平板上的菌落数，计算菌株SQL0164 在水曲柳根表的定殖量。

1.5.3 菌株SQL0164 在水曲柳根表定殖位点的观察

采用扫描电镜（JCM-5000 台式电子显微镜）观察菌株SQL0164 在接种5 d 后的水曲柳幼苗根表的定殖位点。

1.6 菌株SQL0164 定殖相关生物学性状的检测

1.6.1 菌株SQL0164 生物膜形成的检测

取50 μL OD600为0.5 的SQL0164 菌液，加入到含5 mL 培养基的6 孔板中，30 ℃下培养24 h后观察生物膜形态，并利用结晶紫染色法对生物膜进行定量[15]。

1.6.2 菌株SQL0164 运动性的检测

取2 μL OD600为0.5 的SQL0164 菌液，穿刺接种至运动性检测平板中央，30 ℃培养8.5～24 h，记录菌落半径。

1.7 菌株SQL0164 产吲哚乙酸的检测

将菌株SQL0164 接种至含色氨酸的TSB（Tryptic soy broth）液体培养基中，于28 ℃下200 r/min 摇床培养48 h，离心收集上清液，向上清液中加入正磷酸与Salkowski 试剂，溶液变为粉红色即表示有IAA 产生。配制10、20、30、40 和50 mg/L 的标准IAA 梯度溶液，加入正磷酸与Salkowski 试剂反应后，测定溶液在530 nm 处的吸光值，并制作标准曲线。测定菌株SQL0164 液体培养上清夜在530 nm 处的吸光值，依据标准曲线计算液体培养上清液中IAA 的浓度，该实验重复3 次。

2 结果与分析

2.1 水曲柳根系共生细菌SQL0164 对生长的影响

从采集于育苗基地的3年生水曲柳根系、根际以及外周土壤样品中共分离获得细菌分离物113株。其中，根系分离物42 株，根际分离物41 株，土壤分离物30 株。通过测定上述细菌分离物促进苗期水曲柳生长的效果，筛选获得1 株能够显著促进水曲柳幼苗生长的细菌菌株，编号SQL0164，使用该菌株处理的水曲柳幼苗的鲜质量和株高显著高于对照植株（图1），处理组植株的鲜重比对照增加了51%，株高比对照增加了15%。

图1 菌株SQL0164 促进水曲柳幼苗生长的作用Fig.1 Growth-promoting effects of strain SQL0164 on Fraxinus mandshurica seedlings

2.2 菌株SQL0164 的鉴定

2.2.1 菌落、菌体及芽胞的形态观察

在0.1×Trypticase soy agar（TSA）培养基上可观察到，菌株SQL0164 的菌落呈近圆形，扁平，表面粗糙，无色素，有轻微臭味（图2A）。显微镜观察的结果表明，菌株SQL0164 的菌体细胞为杆状，末端方形，长度为3～5 μm，宽度1～1.2 μm（图2B）。

分别吸取接种后24、48、72 与96 h 的SQL0164 菌株培养液（LB），经革兰氏染色，显微镜检测芽胞形成（图2C-F）。观察发现，菌株SQL0164 的革兰氏染色结果呈阳性，接种后24 h菌株SQL0164 未产生芽胞，接种后36 h 可观察到菌株SQL0164 产生的芽胞呈椭圆形或柱形，近中生，长度1～1.5 μm，其中部分芽胞在菌体内部，部分脱离菌体，接种后72 h 菌株SQL0164 产生的芽胞数量最多，接种后96 h 芽胞的数量减少。

图2 菌株SQL0164 的鉴定Fig.2 Identification of strain SQL0164

2.2.2 菌株SQL0164 的16S rRNA 基因序列系统发育分析

以菌株SQL0164 的基因组为模板，PCR 扩增16S rRNA 基因序列，获得长度为1 300 bp 左右的PCR 产物，测序后，将所得序列提交至NCBI数据库，BLAST 比对的结果显示，该序列与蜡样芽胞杆菌Bacillus cereusH7BCTM5 的16S rRNA基因序列同源性最高，达到98%以上，系统发育分析的结果表明，菌株SQL0164 与B.cereusH7BCTM5 的亲缘关系最近（图3）。

2.2.3 菌株SQL0164 的生理生化性状分析

为了进一步确定菌株SQL0164 的分类学地位，对该菌株的生理生化性状进行了分析，结果表明，菌株SQL0164 的甲基红（M.R）、吲哚、水解淀粉、过氧化氢、硝酸盐还原、葡萄糖发酵试验结果均为阳性，V.P 试验与伴孢晶体检测的结果为阴性，该菌株能够耐受浓度为5%的氯化钠，可利用淀粉，不能利用蔗糖、甘露醇、阿拉伯糖和木糖（表1）。依据以上结果检索《伯杰氏系统细菌学手册》，并结合16S rRNA 基因序列分析，菌株SQL0164被鉴定为蜡样芽胞杆菌。

2.3 菌株SQL0164 在水曲柳根表的定殖分析

稳定的定殖于寄主植物的表面或者内部是植物促生根细菌（PGPR）发挥有益功能的前提。为了检测菌株SQL0164 在水曲柳根表的定殖，将菌株SQL0164 接种于MS 培养基中生长的水曲柳幼苗，分别于接种后的第0 天、第5 天、第10 天、第15 天采集根系样品，分离并培养定殖于根表的菌株SQL0164，统计其定殖量（图4A）。结果表明，接种后的第0 天，菌株SQL0164 在水曲柳根表的定殖量为7.3×106CFU/g，随着水曲柳的生长，该菌株在水曲柳根表的定殖量逐渐增加，接种后第5 天的定殖量为1.8×107CFU/g，接种后第10 天，菌株SQL0164 的定殖量达到最大，为5.8×107CFU/g，为该菌株在第0 天定殖量的80 倍。接种后第15 天，菌株SQL0164 的定殖量略微下降，为3.3×107CFU/g，低于第5 天与第10 天的定殖量，但未达到显著水平。综上，在接种后的15 d 内，菌株SQL0164 在水曲柳根表的定殖量随着寄主的生长呈现逐渐增加的趋势。采用扫描电镜对菌株SQL0164 在水曲柳幼苗根表的定殖进行观测，发现该菌株以微菌落的形式聚集并定殖于根表，形成了结构致密的生物膜结构（图4B）。

图3 基于细菌16S rRNA 基因序列的系统发育进化树Fig.3 Phylogenetic tree based on bacterial 16S rRNA gene sequences

表1 菌株SQL0164 的生理生化性状†Table 1 Physiological and biochemical characteristics of strain SQL0164

2 .4 菌株SQL0164 定殖机制的初探

2.4.1 菌株SQL0164 生物膜形成检测

细菌的生物膜形成能力与其在寄主植物上的聚集与附着密切相关。本项研究采用7 种培养基对菌株SQL0164 的生物膜形成进行了检测，结果表明，菌株SQL0164 能够形成漂浮与潜底两种类型的生物膜。生长于0.1TSB、0.1LB、MSGG、0.5NB 培养基中的菌株SQL0164 能够形成致密的漂浮型生物膜，菌株SQL0164 在其它培养基中形成的漂浮型生物膜较为松散（图5A）。采用结晶紫染色对菌株SQL0164 在不同培养基中形成的潜底型生物膜形成进行定量（图5B），结果显示，菌株SQL0164 在LBGM 培养基中生长72 h 后形成的潜底型生物膜的生物量最高，结晶紫洗脱液在570 nm 处的吸光值为0.52，为对照处理的6 倍。

图4 菌株SQL0164 在水曲柳根表的定殖Fig.4 Colonization of Fraxinus mandshurica rhizoplane by strain SQL0164

2.4.2 菌株SQL0164 的运动性检测

细菌的运动能力在其寻找定殖位点的过程中起着关键作用，本研究采用LB 平板[0.2% (w/v)琼脂]与LB 平板[0.7% (w/v) 琼脂]培养基检测了菌株SQL0164 的swimming 与swarming 运动性。结果表明，分别在8.5 h 和24 h 后，菌株SQL0164的菌体遍布整个swimming 与swarming 平板（菌落半径为4 cm），显示出该菌株具有较强的运动性；运动性缺陷的对照菌株AB7 在swimming 与swarming 平板上的半径分别为0.8 cm 与1.2 cm（图6）。

3 讨 论

近年来，PGPR 已被广泛的应用于造林或森林培育过程中。Liu 等[16]研究发现，接种PGPR 能够影响苗期水曲柳的生长和养分的吸收，提高寄主的根与叶等器官的生物量。康丽华等[17]研究表明，在尾叶桉Eucalyptus urophylla苗木的根际土壤中接种Klebsiella oxytocaNG13 pMC73A，能够增加桉树中多种氨基酸和激素的分泌。本研究从水曲柳基地采样并分离到一株蜡样芽胞杆菌Bacillus cereusSQL0164，使用该菌株处理的苗期水曲柳植株的鲜质量和株高均显著高于对照植株（图1）。芽胞杆菌是一类常见的植物共生有益微生物，具有促进植物生长与防治植物病害的功能[18]。Dawwam 等[19]研究表明，蜡样芽胞杆菌p31 通过溶解磷酸盐来刺激马铃薯的生长。蔡学清等[20]将枯草芽胞杆菌BS22 接种辣椒后，使植物体内生长素、赤霉素等内源激素的含量增加，是促生的主要机制。经检测，蜡样芽胞杆菌SQL0164 能够在离体条件下产生吲哚乙酸（IAA），产量为15.1 mg/L。由此推测，菌株SQL0164 可能通过产生IAA 促进苗期水曲柳的生长。

图5 菌株SQL0164 形成的生物膜的形态（A）与定量（B）Fig.5 Morphologies (A) and quantities (B) of the biofilms formed by strain SQL0164

图6 菌株SQL0164 的运动性Fig.6 Motility of strain SQL0164

芽胞杆菌促进植物生长的前提是能够有效的定殖于寄主植物。本研究发现，菌株B.cereusSQL0164 在水曲柳上的定殖量随着寄主的生长而逐渐增加，在接种后的第10 天达到最大值，并趋于稳定。经观察，菌株SQL0164 能够在水曲柳的根表形成微菌落并定殖于根部，该结果与前人的研究结论一致。Fan 等[21]采用电镜及激光共聚焦显微镜观察发现，瓦雷兹芽胞杆菌FZB42 以微菌落的形式聚集并定殖于浮萍的根部。Allard-Massicotte 等[22]研究发现，枯草芽胞杆菌NCIB 3610 接种拟南芥根部12 h 后，就开始以生物膜聚集的方式定殖于根表面。

大量证据表明，细菌在寄主植物根部的定殖与其形成生物膜的能力密切相关。细菌可以通过形成生物膜牢固地定殖于植物的根组织表面。离体条件下，细菌通常在培养液的表面与器皿的壁上形成生物膜，且生物膜的形成为动态过程，可分为可逆性粘附、定殖、成熟及脱落阶段等主要阶段[23]。本项研究发现，菌株SQL0164 在多种培养基中均可形成生物膜，同时，在水曲柳根表面亦观测到菌株SQL0164 形成的生物膜结构，由此推测SQL0164 在水曲柳根表的定殖与其形成的生物膜结构有关。此外，运动性是与细菌在植物根部定殖相关的另一项重要生物学性状。王刚等[24]通过转座子随机插入的方法，构建蜡样芽胞杆菌B3-7 运动性缺陷的突变体B3-7-458，该突变体在小麦根部的定殖能力显著下降，表明菌株B3-7 的运动能力与其在小麦根部的定殖能力紧密相关。本项研究已通过实验证明菌株SQL0164 具有较强的运动能力。为了进一步验证菌株SQL0164 的生物膜形成和运动能力与其在水曲柳根表定殖的相关性，我们将对其进行全基因组测序，并构建生物膜形成与运动能力关键基因的敲除突变体，验证基因功能。

4 结 论

综上所述，本项研究从苗期水曲柳植株的根部分离获得1 株能够显著促进水曲柳幼苗生长的细菌菌株，命名为SQL0164，经16S rRNA 基因序列系统发育分析及生理生化性状检测，菌株SQL0164被鉴定为蜡样芽胞杆菌。将菌株SQL0164 接种于水曲柳幼苗后的15 d 内，该菌株在水曲柳根表的定殖量随着寄主的生长呈现逐渐增加的趋势。菌株SQL0164 在水曲柳根表的定殖能力可能与其显著的生物膜形成能力与运动能力相关。本项研究将为揭示蜡样芽胞杆菌SQL0164 在水曲柳根表的定殖机理奠定理论基础，并为水曲柳促生芽胞杆菌制剂的开发与高效应用提供理论指导。