不同pH 对海湾扇贝胚胎发育及幼虫生长发育的影响*

刘 洋 于瑞海 张 哲 田传远 钱嘉文

(中国海洋大学 海水养殖教育部重点实验室 青岛 266003)

近年来，化石燃料的大量使用，导致CO2过度排放，气温升高、全球变暖、海洋酸化等问题随之出现。海水酸化最终会引起海洋系统内一系列化学变化，从而影响到大多数海洋生物的生理、生长、繁殖、代谢和生存(Haugan et al, 1996)。研究表明，在pH 较低的海水中，贝类、甲壳类和棘皮动物等钙质生物外壳增厚，其作为饵料的价值也随之下降(Caldeira et al,2005)。最新研究表明，地球正在经历近3 亿年来最大规模的CO2排放，海洋生物与海洋生态系统将面临日益加剧的海洋酸化威胁(Ove et al, 2010)。

我国是世界上最大的水产养殖国，双壳贝类作为海水养殖重要经济种类之一，同样面临pH 下降带来的威胁(何盛毅等, 2010)。目前，对厚壳贻贝(Mytilus crassitesta lischlk)、马氏珠母贝(Pinctada martensii)、太平洋牡蛎(Crassostrea gigas) 及青蛤(Cyclina sinensis)的研究表明，酸化海水导致双壳贝类胚胎发育滞缓及幼虫生长缓慢等(Zheng et al, 2014; 刘文广等, 2012; 秦艳杰等, 2013)。另外，王晓琴等(2019)研究发现，pH 变化会对贻贝的矿化、生长和生理过程造成不同程度的影响。海水pH 变化对海湾扇贝(Argopecten irradia)幼贝的研究表明，偏酸环境和偏碱环境均会使幼贝附着力下降，触手不伸出，两壳紧闭，甚至错壳(张明亮等, 2011)。

海湾扇贝原产于美国东海岸，引进我国已30 多年，主要在我国北方沿海养殖，已成为我国主要扇贝养殖品种之一。本研究以海湾扇贝为对象，分析探讨pH 下降对海湾扇贝早期胚胎发育及幼虫生长发育的影响，评估pH 下降对贝类养殖业的影响，旨在为贝类养殖产业在未来应对海洋酸化威胁提供科学数据，为中国海洋环境保护相关措施的制定提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 亲贝采集及幼虫孵化

海湾扇贝亲贝于2018 年3 月26 日取自山东省莱州市长渔水产有限公司。亲贝在室内人工促熟，海水温度为22℃～23℃，采用阴干升温流水刺激法催产。待卵子排放后，洗卵并开始用于pH 影响实验。

1.2 实验设计

本实验以正常海水(pH 8.0～8.2)作为对照组，设置4 个pH 梯度(分别为7.6～7.7、7.3～7.4、7.0～7.1 和6.7～6.8)，每组设3 个重复。

实验期间，受精完成后，按上述pH梯度转移至10 L水体的塑料桶内进行充气培养，水温为22℃～23℃，日常管理与亲贝促熟期间一致；期间投喂球等鞭金藻(Isochrysis galbana)；为避免充气影响各组的pH 值，实时监测和调节pH 值，以减少实验误差。

1.3 pH 对海湾扇贝胚胎发育的影响

将受精卵迅速均分至预先设置的各实验组10 L小桶中，密度为8 ind./ml (取50 ml 定量海水于显微镜下观察，多次测量的平均值作为受精卵密度)；受精卵发育到D 形幼虫时，从各实验组取10 ml 样品，滴加碘液固定，在显微镜下测量壳高、壳长，观察并计算畸形率、孵化率等指标。

1.4 pH 对海湾扇贝幼虫生长发育的影响

取育苗场中发育至30 h 的D 形幼虫，均分至预先设置的各实验组10 L 小桶中，密度为3 ind./ml，测量各实验组初始平均壳高。实验第1～8 天，分别取样测量幼虫的壳高，通过与初始值对比，计算生长速率，每组测量重复3 次。测量各实验组密度，计算各实验组的存活率。

1.5 pH 对海湾扇贝眼点幼虫附着的影响

取育苗场中海湾扇贝眼点幼虫，均分至预先设置的各实验组10 L 小桶中，密度为3 ind./ml，当眼点幼虫比例>50%时，投放附着基(聚乙烯网片)，分别于3、5、7 d 后，测量各实验组眼点幼虫附着变态率。

1.6 数据统计分析

海湾扇贝胚胎发育和幼虫生长各阶段胚胎畸形率(Deformity rate, DR, %)、孵化率(Hatching rate, HR,%)、存活率(Survival rate, SR, %)和综合评价指数(Comprehensive evaluation index, CEI)的计算公式：

式中，Dt为实验结束时畸形D 形幼虫密度；St为实验结束时D 形幼虫总密度；F 为实验起始时受精卵密度；Lo为实验起始时幼虫密度；Lt为实验结束时幼虫密度；He、Hc分别为实验组和对照组的孵化率；Te、Tc分别为实验组和对照组的孵化时间；De、Dc分别为实验组和对照组的畸形率。

采用SPSS 19.0 软件对各组幼虫的生长指标进行单因素方差(One-way AVONA)分析，显著性水平设为P<0.05。

2 结果

2.1 不同pH 对海湾扇贝胚胎发育的影响

在不同pH 条件下，海湾扇贝胚胎孵化率、D 形幼虫畸形率以及生长情况见表1、图1 和图2。

从表1 和图1 可以看出，不同pH 对海湾扇贝孵化率、畸形率以及孵化时间均有显著影响(P<0.05)。在孵化率方面，实验组与对照组均差异显著(P<0.05)，pH 7.6～7.7 时，孵化率为43.75%，仅为对照组的一半；在畸形率方面，实验组与对照组同样差异显著(P<0.05)，pH 6.7～6.8 时高达48.39%，而对照组仅为4.76%，相差近10 倍，并且随着pH 的降低，畸形率不断升高；孵化时间方面，孵化时间随着pH 的下降呈现递增趋势，当pH 下降至6.7～6.8 时，孵化时间相比对照组延长了8 h。

为评估pH 对海湾扇贝胚胎发育的综合影响，引入综合评价指数。从表1 可以看出，酸化程度越大，对海湾扇贝胚胎发育的影响越大。从图2 可以看出，对照组壳长、壳高明显高于各实验组，差异显著(P<0.05)；且各实验组壳长与壳高随着pH 的降低明显下降，pH 7.0～7.1 实验组与对照组相差近12 μm。

图1 不同酸化程度下30 h 时孵化率和畸形率Fig.1 Hatching rate and deformity rate at different acidification level for 30 h

2.2 不同pH 对海湾扇贝D 形幼虫生长发育的影响

图2 不同酸化程度下30 h 时各组D 形幼虫的壳长和壳高Fig.2 Shell length and shell height of D larvae in each group at different acidification level for 30 h

不同pH 条件下，海湾扇贝D 形幼虫生长发育见图3 和图4。从图3 可以看出，不同pH 条件下，D 形幼虫对照组存活率均高于实验组，且差异显著(P<0.05)。4 d 内，pH 7.6～7.7 实验组存活率下降幅度较小，而pH 7.3～7.4、pH 7.0～7.1、pH 6.7～6.8 实验组下降幅度较大，但各组内仍差异显著(P<0.05)，仅在第4 天时，pH 7.3～7.4 与pH 7.0～7.1 两组差异不显著(P>0.05)；第4 天时，pH 6.7～6.8 实验组存活率达到最低，为39.1%。

表1 不同酸化程度下孵化时间、畸形率和孵化率差异Tab.1 Differences in hatching time, deformity rate and hatching rate under different acidification level

图3 不同酸化程度下D 形幼虫存活率Fig.3 Survival rate of D-larvae at different acidification level

从图4 可以看出，不同pH 条件下，D 形幼虫期间对照组生长速率均显著高于实验组(P<0.05)。4 d 内，pH 7.6～7.7组生长速率均显著高于其他实验组(P<0.05)；第1 天，除pH 7.0～7.1 与pH 6.7～6.8 两组间差异不显著(P>0.05)外，其余各组间均差异显著；第2 天，pH 7.3～7.4、pH 7.0～7.1 两组间差异不显著(P>0.05)，其余各组间均差异显著；第4 天时，实验组pH 6.7～6.8 生长速率最慢，仅为5.5 μm/d，而对照组生长速率均保持在10 μm/d 以上。

图4 不同酸化程度下D 形幼虫的生长速率比较Fig.4 Growth rate of D-larvae at different acidification level

2.3 不同pH 对海湾扇贝壳顶幼虫生长发育的影响

从图5 可以看出，不同pH 条件下，壳顶幼虫期对照组存活率与实验组差异显著(P<0.05)。幼虫发育至第7 天，pH 下降0.7～0.8 及更多时，存活率下降幅度较大，存活率均在20%以下；幼虫发育至第8 天，实验组pH 7.0～7.1 和pH 6.7～6.8 的存活率分别为6.1%和5.6%。实验组pH 7.6～7.7 与其他实验组相比，虽保持较高存活率，但幼虫发育至第8 天时，存活率仅为38.7%，而对照组存活率仍保持较高水平，为75.2%。从图6 可以看出，壳顶幼虫期各组生长速率均差异显著(P<0.05)，壳顶幼虫发育期内，生长速率均随pH 下降而降低。发育至第8 天时，pH 7.3～7.4组及以下的生长速率极低，基本呈生长停滞状态。

图5 不同酸化程度下壳顶幼虫存活率比较Fig.5 Survival rate of umbo larvae at different acidification level

图6 不同酸化程度下壳顶幼虫生长速率Fig.6 Growth rate of umbo larvae at different acidification level

2.4 不同pH 对海湾扇贝眼点幼虫附着的影响

不同pH 条件下，各组海湾扇贝眼点幼虫附着率情况见图7。从图7 可以看出，除第7 天，pH 7.0～7.1组比 pH 7.3～7.4 组附着率高，二者差异不显著(P>0.05)，在第3 天和第5 天时，幼虫附着率均随pH的下降而降低，且对照组与各实验组间差异显著(P<0.05)。第7 天时，对照组附着率最高达到88.7%，而pH 6.7～6.8 实验组附着率仅为31.7%。

图7 不同酸化程度下各组海湾扇贝眼点幼虫附着率Fig.7 Larval adhesive rate of gulf scallop larvae at different acidification level

3 讨论

目前，全球海洋酸化正以前所未有的速度快速发展，据统计，海洋酸化已达到1400 万年来未见的水平。环境的恶化对经济贝类的早期生长发育影响巨大，且直接关乎人工育苗的成败，环境的改变能够很大程度地影响幼虫的孵化以及生长存活(Goulletquer et al, 2002; Simon et al, 2006; Gazeau et al, 2011)。海水pH 作为重要的环境因子之一，国内外对此研究较少，而主要集中于海水盐度、饵料、温度以及重金属方面(刘文广等, 2014; James et al, 2005)。

3.1 pH 对海湾扇贝胚胎发育的影响

研究表明，pH 对海湾扇贝胚胎发育的孵化率、畸形率及孵化时间均有显著影响。在孵化率方面，与对照组相比差异显著(P<0.05)，且随着pH 的降低，孵化率反而有上升趋势，pH 6.7～6.8 实验组的孵化率达到60.0%，比pH 7.6～7.7 实验组高出17.0%，这种情况可能是因为胚胎发育早期仅依靠自身卵黄发育，外界环境对其影响较小所致(刘文广等, 2012; 尼贝肯,1991)。何盛毅等(2011)对马氏珠母贝的研究显示，pH=7.7 时，D 形幼虫孵化率[(16.6±12.0)%]显著低于对照组[(44.8±7.4)%]，且畸形率[(48.2±9.1%)]比对照组高3 倍；蔡娟等(2016)对青蛤的研究显示，低pH值和高pH 时，胚胎发育没有明显滞后，但pH 7.4 组与pH 9.0 组的原肠期胚体转动速度较对照组慢；另外，Kurihara 等(2008)研究pH 7.4 的酸化海水对太平洋牡蛎和紫贻贝(M. edulis)胚胎发育的影响，表明胚胎发育基本不受酸化海水的影响；Gazeau 等(2010)通过研究紫贻贝发现，pH 为7.6 条件下，其D 形幼虫孵化率[(24.0±4.0)%]，比对照组(pH=8.1)条件下低[(12.7±0.9)%]，这些结果与本研究结果基本一致，说明pH 的降低对海湾扇贝胚胎孵化具有较大影响。

在畸形率方面，D 形幼虫畸形率在紫贻贝(Gazeau et al, 2010)、太平洋牡蛎(Kurihara et al, 2008)及中间球海胆(Strongylocentrotus intermedius)(秦艳杰等, 2013)中都出现过。本研究发现，畸形率随pH 的下降呈现上升趋势，最高达到48.4%。Kurihara 等(2008)研究发现，太平洋牡蛎幼虫也会出现明显的畸形，pH 为7.4 时，畸形率高达80%，这比海湾扇贝幼虫表现的更为明显。秦艳杰等(2013)对中间球海胆的研究显示，实验组长腕幼虫畸形均不同程度地表现为腕短小、萎缩、腕骨针折断、骨针弯曲变形等。这些研究结果均表明，D 形幼虫的正常生长对外界酸性条件非常敏感，如果海洋酸化持续加剧，海湾扇贝幼虫将面临巨大的威胁(王有基等, 2014; Victoria et al,2008)。

胚胎发育过程中，pH 下降对其孵化时间也有显著影响。结果显示，在pH 为6.7～6.8 时，发育至D形幼虫的时间为29 h，而对照组仅为21 h。蔡娟等(2016)对青蛤(Cyclina sinensis)的研究报道了相似的结果，实验组与对照组相比，pH 7.4 组匍匐期发育时间延迟约48 h，单水管期发育时间延迟约68 h，囊胚期纤毛轮转动慢于对照组，且一直延续至担轮幼虫。这可能是因为胚胎期完全暴露于酸化环境中，使幼虫改变了摄食渠道，从外界获取食物、环境适应能力差异导致(刘文广等, 2012; 尼贝肯, 1991)。相反，Kurihara 等(2009)研究发现，地中海贻贝(Mytilus galloprovincialis)胚胎发育过程基本不受酸化海水的影响，同样，可能是胚胎发育早期仅依靠于自身的卵黄发育，外界环境对其影响较小所致(刘文广等, 2012;尼贝肯, 1991)。

3.2 pH 对海湾扇贝幼虫生长发育的影响

存活率是反映贝类幼虫对环境耐受性的重要指标(尼贝肯, 1991)。当环境条件不适应时，可能会抑制贝类幼虫的钙化过程，导致其生长缓慢，甚至死亡(Kurihara et al, 2009)。结果显示，随着pH 的降低，存活率也同时下降。Dove 等(2007)对岩牡蛎(Saccostrea glomerata)的研究发现，被酸化的河口地区牡蛎死亡率高且生长速度慢。Watson 等(2009)对岩牡蛎的研究中也发现同样的结果，在pH 下降0.3 的情况下，存活率下降了43.0%；在pH 下降0.5 的情况下，存活率下降了72.0%，这与本实验结果相近。

影响幼虫生长发育的因素包括环境因素、自身发育阶段因素以及幼虫的耐受性等(Gatos et al, 1998)。海水pH 作为重要的环境因子之一，加之海洋酸化的加速，对于幼虫的生长发育是一个巨大的挑战。海洋酸化由于CO2的过度溶解，会打破海水中碳酸钙溶解平衡，而碳酸钙作为形成贝类贝壳及海洋生物骨骼的重要物质，pH 下降会阻碍某些生物形成碳酸钙的能力，进而影响该生物的生长、繁育(Gatos et al, 1998)。对于双壳贝类，Green 等(2004)研究发现，在pH 为7.4 的条件下，太平洋牡蛎幼虫发育缓慢，钙化程度降低，并且个体多数出现少壳缺壳现象；Gazeau 等(2010)在紫贻贝的研究中发现，当pH 下降0.25～0.34时，在2 d 和13 d 时的壳高分别下降了4.5%和6.0%；当pH 下降0.5 时，15 d 时的壳厚下降了12.0%。本研究结果与前述研究结果基本相同，这说明酸化海水对于幼虫的影响仍然存在，并且幼虫的耐受性相比之前大幅下降。同样，在对马氏珠母贝(何盛毅等, 2011)的研究中发现，D 型幼虫生长缓慢，且畸形率远远高于对照组；在Green 等(2004)对幼年硬壳蛤(Mercenaria mercenaria)研究发现，在文石不饱和水体中死亡率显著增加，外壳在2 周内全部溶解。研究表明，导致海洋生物生长发育缓慢可能是因为其细胞渗透压发生改变，为了维持体内的酸碱平衡，必然会转移部分用于其他生理过程的能量进行反馈补偿性代谢，影响了生物其他的正常生理活动，导致生长发育变慢(湛垚垚等, 2013)。这些研究结果均表明，酸化海水对贝类的生长发育影响巨大。Cooley 等(2009)预测，到2060 年，海洋酸化将会给美国贝类产业带来严重影响，将造成14 亿美元的经济损失。

3.3 pH 对海湾扇贝眼点幼虫附着的影响

当眼点幼虫比例>50%时，需要投放附着基，此时是贝类由浮游幼虫向稚贝转变的重要发育阶段。当环境发生变化时，幼虫会出现附着延长或者不附着等，甚至死亡(张涛等, 2001)。本研究结果显示，随着pH 的降低，附着率降低，第7 天时，对照组附着率最高达到88.7%，而pH 6.7～6.8 实验组附着率仅为31.7%。Welladsen 等(2010)对合浦珠母贝(Pinctada fucata)研究显示，pH 7.8 和7.6 酸性条件下，足丝的生产数量和总长度与对照组相比，没有明显差异，但在pH 7.6 条件下，珠母贝足丝明显比对照组细。另外，Donnell 等(2013)研究发现，高浓度CO2条件下，贻贝足丝韧性下降，与对照组相差40.0%。结果表明，pH 下降会削弱双壳贝类的附着能力。

4 结语

通过研究不同pH 条件下海湾扇贝胚胎发育及幼虫生长情况，证明pH 下降对双壳贝类的影响巨大，说明海水酸化的不断加剧，将严重影响海洋中的生物，尤其是甲壳类、无脊椎生物的生存。总之，pH下降问题涉及各海域海洋生物及生态系统，尤其是近岸海域。需开展进一步研究，寻找不同贝类在遗传及生理等水平上对酸化海水的响应及适应情况，积极采取应对措施，构筑海洋生态屏障。