儿童与成人金黄色葡萄球菌分离株Ⅰ类整合子调查分析

李相新，郑芬，李凯

(南方医科大学附属佛山妇幼保健院检验科，广东佛山 528000)

整合子是细菌中天然的克隆表达系统，是一种具有位点特异性重组功能的基因片段，能识别、俘获及表达外来移动性基因盒[1]。作为可移动性基因元件，一方面整合子可通过对基因盒的捕获和剪切使基因盒发生移动，另一方面整合子自身可位于转座子、质粒等可移动基因元件上，借助可移动耐药元件使整合子发生移动，造成耐药基因的播散。研究显示，大多数革兰阴性杆菌均携带Ⅰ类整合子结构，其中尤以肠杆菌科细菌携带率高，携带耐药基因盒种类多样并不断演变出新的耐药基因盒组合方式[2-4]。而对革兰阳性球菌中整合子的研究较少。本研究将调查临床分离金黄色葡萄球菌Ⅰ类整合子携带情况，并比较分析儿童和成人分离菌株间携带的差异性以及与耐药性的关系。

1 材料和方法

1.1菌株来源 收集2018年1月至2019年6月南方医科大学附属佛山妇幼保健院临床分离金黄色葡萄球菌600株，剔除重复分离菌株，其中分离自成人和儿童分别为153株和447株；来源于呼吸道268株、脓液171株、生殖道分泌物57株、脐分泌物51株、眼分泌物20株、尿液16株、粪便11株和血液6株。用BD Phoenix 100进行细菌鉴定和药敏试验，根据美国临床和实验室标准化协会(CLSI)M100 2018年标准[5]进行药敏结果判读。金黄色葡萄球菌ATCC 29213由广东省临床检验中心提供；Ⅰ类整合酶和整合子阳性对照菌株NF813152由南方医院惠赠，阴性对照菌株金黄色葡萄球菌ATCC 25923由广东省临床检验中心提供。

1.2主要仪器和试剂 Phoenix 100细菌鉴定和药敏分析仪(美国BD公司)；PCR扩增仪(德国Eppendorf公司)；GeldocXR凝胶成像仪(美国Bio-Rad公司)；细菌组DNA提取试剂盒(Tiangen公司)；Taq DNA聚合酶、dNTPs、蛋白酶K、Hinf Ⅰ、引物合成(日本TaKaRa公司)。

1.3细菌DNA模板制备 按照细菌组DNA提取试剂盒说明书进行模板DNA的提取，洗脱后的DNA置于无菌EP管，于-20 ℃保存。

1.4Ⅰ类整合酶基因扩增 参照文献[2]合成Ⅰ类整合酶基因，采用PCR方法进行扩增检测。引物为int1-F：5′-GCATCCTCGGTTTTCTGG-3′和int1-R： 5′-GGTGTGGCGGGCTTCGTG-3′，目的片段长度为457 bp。PCR反应总体系为20 μL：含Mg2+的10×buffer 2 μL，dNTP 1.6 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，DNA模板1 μL，Taq DNA聚合酶1 U，加入灭菌去离子水至20 μL。PCR反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，57 ℃ 1 min，40个循环；72 ℃ 10 min。每个PCR反应均设相应的阳性对照和阴性对照。PCR反应结束后，取5 μL扩增产物行10 g/L琼脂糖凝胶电泳，并用GeldocXR凝胶成像仪读取电泳结果。

1.5Ⅰ类整合子可变区扩增 参照文献[2]合成整合子可变区扩增引物，引物序列为kb-5：5′-GGCATCCAAGCAGCAAG-3′和kb-3：5′-AAGCAGACTTGACCTGA-3′，扩增片段长度可变。PCR反应体系同Ⅰ类整合酶基因扩增体系，反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，57 ℃ 4 min，35个循环；72 ℃ 10 min。每次PCR反应设相应的阳性对照和阴性对照。PCR反应产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳观察。

1.6Ⅰ类整合子可变区限制性片段长度多态性(RFLP)及序列测定 将1.5部分可变区阳性PCR产物采用核酸限制性内切酶Hinf Ⅰ进行酶切[2]，并经10 g/L琼脂糖凝胶电泳观察。选取不同酶切谱型中1～2株送华大基因公司用ABI 3730XL测序仪进行Sanger双向测序分析，结果经Blast比对分析。

1.7统计学分析 用SPSS 18.0软件进行分析。率的比较采用卡方检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1Ⅰ类整合酶基因分布及可变区基因盒 600株金黄色葡萄球菌中236株检出Ⅰ类整合酶基因，检出率为39.3%。236株Ⅰ类整合酶基因阳性菌株中有193株Ⅰ类整合子可变区扩增阳性，43株未检测到基因盒。RFLP分型显示，可变区分为13种酶切类型，经测序检出14种基因盒，以aadA1和dfrA1检出最多，均为37株。儿童分离株中dfrA12检出率最高，成人分离株中aadA1检出率最高；成人与儿童分离株中Ⅰ类整合酶和整合子可变区阳性检出率差异无统计学意义；dfrA12基因盒在儿童分离株检出率显著高于成人分离株，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 成人与儿童整合子检出率比较[n(%)]

2.2Ⅰ类整合子检出与耐药率的比较 236株Ⅰ类整合子阳性分离菌株对苯唑西林、庆大霉素、红霉素、环丙沙星、复方磺胺、克林霉素、甲氧苄啶和氯霉素耐药率高于364株Ⅰ类整合子阴性分离菌株，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

2.3成人和儿童耐药率及整合子的检出比较 儿童分离株对甲氧苄啶和红霉素的耐药率高于成人分离株，差异有统计学意义(P<0.05)，而成人分离株对环丙沙星耐药率高于儿童分离株，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。介导磺胺类耐药基因盒在儿童分离株中有较高携带率(19.24%，86/447)，高于成人分离株(10.46%，16/153)，差异有统计学意义(χ2=6.23，P=0.013)，其他基因盒的携带情况在上述人群分布差异无统计学意义。

表2 Ⅰ类整合子阳性菌株与阴性菌株耐药率比较[n(%)]

表3 成人与儿童分离株耐药率比较[n(%)]

3 讨论

本研究中金黄色葡萄球菌Ⅰ类整合酶检出率为39.3%，与相关报道基本一致[6]，表明Ⅰ类整合子可普遍存在于金黄色葡萄球菌中。本文检出的基因盒有氨基糖苷类耐药基因(aacA4、aadA1、aadA2、aadA4、aadB、aadA5)、氯霉素耐药基因(cmlA6)、甲氧苄啶耐药基因(dfrA1、dfrA12、dfrA17、dhfrV)、季铵盐耐药基因(qacH)，主要介导编码氨基糖苷类、氯霉素、甲氧苄啶及季铵盐耐药，与文献报道基本一致[6]。本研究以aadA1和dfrA1两种整合子基因检出率最高，而文献[5]以dfrA1+aadA1检出最多，可见金黄色葡萄球菌Ⅰ类整合子携带aadA1和dfrA1耐药基因盒居多。通过比较发现Ⅰ类整合子阳性菌株对庆大霉素、复方磺胺、甲氧苄啶和氯霉素的耐药率均高于Ⅰ类整合子阴性菌株，与菌株所携带相应耐药基因盒介导菌株对相关抗菌药物耐药具有一致性。同时发现，Ⅰ类整合子阳性菌株较不含Ⅰ类整合子菌株对苯唑西林、红霉素、克林霉素和环丙沙星表现出更高的耐药性。由此可见，菌株携带Ⅰ类整合子可能同时介导其他多种抗菌药物的联合耐药表型。

本研究发现，成人与儿童分离金黄色葡萄球菌菌株Ⅰ类整合酶和Ⅰ类整合子可变区阳性检出率差异无统计学意义。对检出的13种Ⅰ类整合子基因盒比较发现，仅dfrA12在儿童分离株中较成人高(P<0.05)。将同类基因盒合并统计分析，发现介导磺胺类耐药基因盒(dfrA1、dfrA12、dfrA17、dhfrV)在儿童分离株中有更高的携带率(P<0.05)，而介导氨基糖苷类耐药基因盒(aacA4、aacA4、aadA1、aadA2、aadA4、aadB、aadA5)、氯霉素(cmlA6)和季胺盐(qacH)耐药基因盒携带率在成人与儿童分离株中的检出率差异无统计学意义。比较分析成人与儿童分离菌株对各类抗菌药物的耐药率发现，仅有甲氧苄啶、红霉素和环丙沙星表现出耐药性差异。甲氧苄啶在儿童分离菌株中表现出更高的耐药率，而磺胺类耐药基因盒，尤其是dfrA12在儿童分离菌株中的检出率更高，具有一致性。本次研究未检出红霉素和环丙沙星耐药基因盒，表明Ⅰ类整合子未参与耐药形成。儿童分离菌株对红霉素的耐药率高于成人，环丙沙星在成人分离株中耐药率更高，可能与儿童和成人的用药习惯有关。