巨菌草根部促生菌的筛选及其促生效应

邓振山 陈凯凯 李静 刘显春 张宝宝 张宝成

摘 要：为进一步开发植物促生菌，该研究以巨菌草根部为主要材料进行巨菌草促生菌的筛选，采用解磷、固氮和产IAA等筛选标准对初筛菌株分别进行多项促生能力的测定。通过形态观察、生理生化特性和 16S rDNA序列同源性分析对促生效果最好的菌株YB-07进行分类和鉴定，分别测定其促生能力后从中筛选出促生效应强的11个菌株进行盆栽试验，并通过对这些菌株单独回接和多菌混接的小麦盆栽试验测定其对小麦的促生效应。结果表明：从巨菌草根部分离得到了101株促生菌株，分类鉴定结果显示菌株YB-07归属于根瘤菌属（Rhizobium），其溶磷量为20.1 mg·L-1、产IAA量为23.7 mg·L-1，同时具有产氨能力。盆栽试验测定结果显示，多菌混合接种对小麦的促生效应在株高、干重、鲜重和叶绿素含量上，分别较对照组增加了24.49%、31.84%、28.06%和34.14%。单菌接种对小麦的促生表现在株高、干重、鲜重和叶绿素含量上，分别较对照组增加了13.54%、20.45%、16.84%和35.19%。所筛选到的菌株具有良好的促生长作用，能为进一步构建巨菌草促生菌菌群提供良好的种质资源。

关键词：巨菌草，促生菌，筛选，促生效应，盆栽试验

中图分类号：Q939.95

文献标识码：A

文章编号：1000-3142（2020）09-1323-09

Abstract：

In this study，the root of the Pennisetum sinese was used as the main research material，screening of growth-promoting strains from P. sinese，and explore the growth-promoting effects of growth-promoting strains. We used the following screening criteria for the determination of multiple growth-promoting capacities of primary strains：the ability to solubilize phosphorus，the ability to fix nitrogen，the ability to produce IAA. The strain YB-07 with the best growth-promoting effect was classified and identified through physiological and biochemical characteristics and 16S rDNA sequence homology analysis. Eleven strains with better overall performance were screened out and used for a pot experiment with a single inoculation and multi-microbe mixed inoculation to determine its growth-promoting effect. A total of 101 strains were isolated from the roots of the P. sinese，and the growth-promoting ability was measured. Among them，the strain with excellent overall performance was YB-07，which had a phosphorus content of 20.1 mg·L-1，an IAA yield of 23.7 mg·L-1，and an ability to produce ammonia at the same time. The results of pot experiment showed that the effect of multi-microbe mixed inoculation on wheat growth increased by 24.49%，31.84%，28.06% and 34.14% in the height，dry weight，fresh weight and chlorophyll content，respectively. Single bacterium inoculation increased the plant height，dry weight，fresh weight，and chlorophyll content by 13.54%，20.45%，16.84% and 35.19%，respectively，compared with the control group. The selected strain has good growth-promoting effect，can provide a good seed resources for the further construction of the P. sinese flora promoting bacteria.

Key words：Pennisetum sinese，promoting bacteria，screening，growth-promoting effect，pot experiment

巨菌草（Pennisetum sinese）隸属于禾本科狼尾草属，多年生，适宜在热带、亚热带、温带生长和人工栽培。巨菌草是2005年—2007年间由福建农林大学菌草研究所在南非引进的品种，因其在当地生长时植株特别高大，所以将其暂命名为巨菌草，后经鉴定其与国内其他狼尾草略有差别，现正在申报新品种认定。巨菌草属于典型的C4植物，其植株高大，株高一般为3～5 m，抗逆性强，产量高，粗蛋白和糖分含量高（林兴生等，2013）。植物内生菌在现今植物微生物学、微生物学应用研究领域中已占据越来越重要的位置，主要归功于其具有很多有益的生物学特性，如内生细菌具有增加宿主溶磷（王丽萍等，2015）、分泌吲哚乙酸（IAA）（罗菲等，2011）、固氮（Webster et al.，1997）等促进植物生长的作用。目前，巨菌草已用于香茹、黑木耳等多种食用药用菌的栽培（王丽萍等，2015），但对巨菌草的研究大多集中在抗寒、抗碱、抗盐、抗旱等方面（林兴生等，2013;王丽萍等，2015）。

自在延安地区实施“退耕还林还草工程”以来，采取封山育林措施，将畜牧业养殖模式由传统的“散养型”改为“圈养型”，从而导致饲草短缺成为了制约延安地区畜牧业发展的瓶颈。为解决饲草短缺、成本高以及“治沟造地工程”土壤改良的问题，2012年延安大学科研人员从国家菌草工程研究中心成功引种巨菌草到延安市，经过多年的试验和示范，已成功推广了2 000 hm2，促进了当地畜牧业的发展。然而，关于巨菌草内生菌的相关研究目前很少见有报道。本研究以巨菌草为材料，从中筛选出具有促生效应的内生细菌菌株，并采用单菌接种和多菌混合接种的方法，根据盆栽试验结果，测定所筛选菌株的促生效应，以期为进一步开发植物促生菌提供种质资源以及延安地区巨菌草高效规范化管理与示范推广提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 巨菌草根部样品的采集及前期处理  巨菌草根部样品从延安大学翠园巨菌草示范基地采集，用五点采样法，选择生长性状良好、无病害症状的健康巨菌草植株体根部样品80个，用灭菌袋包装带回实验室。4 ℃低温保藏，48 h内处理完。

1.1.2 盆栽试验土壤来源及处理  用于盆栽试验的土壤采自延安大学的后山，采集完成后，灭菌袋装好带回实验室。用筛子（5 mm）筛除土壤中大颗粒的土壤、沙石、植物根和未完全腐烂的落叶、枝条等杂质。处理后的土壤装入塑料盆中待用（塑料盆直径12 cm），每盆装入土壤1.5 kg，待用。

1.1.3 供试培养基 （1）LB培养基：蛋白胨10 g，NaCl 10 g，酵母膏5 g，蒸馏水 1 000 mL，pH7.0。（2）PDA培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂15～20 g，蒸馏水1 000 mL，自然pH。（3）阿须贝（Ashby）培养基：葡萄糖或甘露醇10.0 g，KH2PO4 0.2 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，NaCl 0.2 g，CaSO4·2H2O 0.1 g，CaCO3 5.0 g，琼脂15～20 g，H2O 1 000 mL，pH7.0。（4）解磷细菌培养基：NaCl 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，MnSO4·4H2O 0.03 g，KCl 0.3 g，（NH4）2SO4 0.5 g，FeSO4·7H2O 0.03 g，Ca3（PO4）2 5.0 g，蔗糖 10 g，琼脂 15～20 g，H2O 1 000 mL，pH7.0～7.5。（5）NA培养基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，蔗糖10 g，琼脂15 g，蒸馏水1 000 mL，pH7.0。（6）产IAA培养基：KH2PO4 0.5 g，酵母膏1 g，甘露醇10 g，MgSO4 0.2 g，NaCl 0.1 g，色氨酸100 mg，蒸馏水1 000 mL，pH6.8～7.2。

1.2 方法

1.2.1 样品的表面消毒 首先将巨菌草根部用自来水将附着在根部样品表面的残留土冲洗干净，用吸水纸吸干根部表面的水。接着将根部样品浸泡在浓度为75%的乙醇中，浸泡2～3 min，无菌ddH2O冲洗3次，灭菌的吸水纸吸干后，将根部样品浸泡在浓度为0.1%的 HgCl2 溶液中，浸泡时间为3 min，取出立即用无菌ddH2O冲洗6次，确保消毒劑的无残留。最后将最后一次冲洗的无菌ddH2O涂布到同样的培养基上用于检测根部样品的表面消毒是否彻底（王志勇和刘秀娟，2014）。

1.2.2 促生菌株筛选 将表面消毒彻底的巨菌草根部样品截成约1 cm的小段，将根段放入筛选培养基中（培养基包括PDA培养基、产IAA培养基、Ashby培养基和解磷培养基等），于（28±1）℃恒温静置培养3～5 d。待培养基中有可见菌落时，挑取周围菌落移入相应培养基纯化，并进行菌落形态描述、编号和置于4 ℃冰箱中备用。将最后一次冲洗的无菌水涂布于培养基上作为对照，于恒温静置培养，检验表面消毒是否彻底。

1.3 促生能力的测定

1.3.1 紫外分光光度计法测定吲哚乙酸含量 将筛选获得的菌株接入PDA培养基中，在180 r·min-1、28 ℃的条件下摇床培养48 h。培养后各取3 mL的菌液，10 000 r·min-1离心8 min，取离心好的上清液1 mL，并加入2 mL的Salkowskis （10.8 mol·L-1 H2SO4含 4.5 g 的FeCl3）反应液。在暗处静置混合反应 30 min。测定OD540 nm的值，使用标准品绘制标准曲线。将测得的数值代入标准曲线获得产吲哚乙酸的含量。用去离子水作为对照处理（田宏等，2005）。

1.3.2 钼蓝比色法测定处理液中的磷含量 分别取配置好的 50 μg·mL-1的含磷标准液各0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mL，分别置于20 mL具塞试管中，分别先加蒸馏水至 6 mL，再加入1 moL·L-1的硫酸溶液2 mL、2 mL铁钼酸试剂，混匀。静置 15 min以后，用比色皿在分光光度计OD660 nm波长处测定吸光度。用所得数据绘制标准曲线，根据测出的吸光度通过标准曲线方程计算待测样品溶液的磷含量（张祥胜，2008）。

1.3.3 产氨能力的测定 将待测菌株接种到NA培养基中，置于180 r·min-1、28 ℃的条件下摇床培养48 h，取100 μL/5 mL 接种于阿须贝液体培养基中，以接种无菌水为对照，每处理3个重复，置于 28 ℃ 恒温下培养，7 d 后观察对比试验组与对照组的浑浊情况，明显浑浊的为阳性，即为有固氮活性（王娜娜，2010;Zahoor et al.，2017）。另将待测菌株接入蛋白胨（10 g·L-1）培养液的试管中，加入0.5 mL Nesslers试剂，出现黄褐色沉淀的为产NH3阳性反应（王刚等，2009）。

1.4 菌株的鉴定

1.4.1 培养特征的观察 将菌株YB-07采用平板划线法接种于NA培养基中，28 ℃ 培养1～2 d，观察并记录单菌落特征。

1.4.2 生理生化鉴定 将菌株YB-07进行革兰氏染色、甲基红测定、V-P测定、淀粉水解、吲哚试验、油脂水解和明胶水解试验。试验测定及初步鉴定参考《微生物学实验》的方法（蔡信之和黄君红，2010）。

1.4.3 16S rDNA序列测定及系统发育树分析 测定初筛菌的促生能力后，选择具有多种促生效应的优势菌株YB-07进行鉴定。对菌株YB-07 16S rDNA基因片段进行PCR扩增和测序，获得GenBank登录号后，运用MEGA 6.06 软件，选用邻接法（Neighbour-Joining）构建系统发育树，分析菌株的系统发育学特征（张磊等，2017;张苗苗等，2017）。

1.5 盆栽试验

1.5.1 小麦种子处理 采用小麦（品种为陕优225号）进行盆栽试验，将陕优225小麦种子先用冷水预浸泡4～6  h，捞出后再用52～55 ℃温水浸泡1～2 min，使种子温度达到 50 ℃，捞出后放入56 ℃ 温水中，浸泡5 min取出，用凉水冷却后晾干播种。

1.5.2 促生菌株间亲和性测试 采用划线接种的方法测试菌株之间是否存在拮抗作用。将待测的促生菌株分别两两交叉接种于PDA培养基上，放入恒温箱中，28 ℃培养 2～3 d。若两两交叉划线处菌株能够正常生长，则菌株间无拮抗作用，说明可以制作复合菌悬液进行试验。

1.5.3 接种菌剂的制备 将选取的促生菌菌株接种于LB液体培养基中，在25 ℃、180 r·min-1的条件下培养48 h。各取培养物装入3 mL 离心管中，10 000 r·min-1离心10 min，弃上清液，加入生理盐水1 mL制备成菌悬液，并按表1的设计方法（多菌混合组，包括：固氮、溶磷混合组;溶磷、产IAA混合组;固氮、溶磷与产IAA混合组）处理后，分别取1.2 mL（2.0×109 个·mL-1）接种于灭菌后的LB液体培养基中，于28 ℃、160 r·min-1下培养2～3 d，可获得菌株接种剂。

1.2 mL无菌水

1.2 mL sterile water

1.5.4 接种处理 每次选取 5 粒饱满、大小均匀的小麦种子进行播种，5个播种点均匀分布，种子离土表面 3～5 cm。每个处理设 3 个重复，自然光照下培养。在种子催芽过程中，每周每个处理每次接种浓度为2.0×109 个·mL-1的菌悬液1.2 mL，同时对照组接种等量的无菌水，土壤湿度保持为60%。15 d后测定小麦苗子的株高、根长、鲜重、叶绿素含量等指标，并做统计学分析。

2 结果与分析

2.1 菌株的筛选

用多种不同的培养基，从巨菌草根部样品中经分离、纯化共获得 101株菌株，分别测定促生能力后，从中筛选出促生效果好的11株菌株进行后续的促生试验。其中有8株具有产氨能力，6株具有溶磷能力，3株具有产IAA能力（表2）。

2.2 促生能力的测定

通过试验分别测定了11株促生能力较强菌株的促生指标，其结果见表3。从表3可以看出，菌株YB-07同时具有产氨能力、产IAA和溶磷三种促生能力;菌株NP-01的溶磷量最高，溶磷量为45.1 mg·L-1;具有产IAA能力的三株菌IAA产生能力相差不大，其中菌株N-01产量最大（达到了26.5 mg·L-1）菌株YB-07同时具有产氨能力、产IAA和溶磷三种促生能力，因此本文选取该菌株作为代表菌株进行后续研究。

2.3 促生菌株间亲和性测试

菌株N-02与NP-01、N-01、N-02与NP-01及菌株YB-07、YB-08、YB-09与YB-10两两划线交叉处均有菌株生长，表明这些菌株间无拮抗作用，可以用作混合菌剂的制备。

2.4 菌株YB-07的鉴定

2.4.1 培养特征观察 将观察菌株YB-07在NA培养基中培养2 d后形成的菌落，形状近圆形，粘稠状，半透明，边缘整齐，表面稍凸起而富有光泽（图1）。

2.4.2 生理生化特征 菌株YB-07的生理生化测定结果如表4所示。

2.4.3 16S rDNA序列测定及系统发育分析 经NCBI的Blast比对结果显示，菌株YB-07与根瘤菌属（Rhizobium）的相似度为99.67%，因此归属于根瘤菌属（Rhizobium），其GenBank登录号为KY852244，其系统进化树如图2所示。

2.5 盆栽试验的结果

小麦在培养15 d后，对进行不同处理的小麦各种形态学参数进行测量（表5）。由表5可知，除个别外（如在叶绿素含量上处理N3高于处理PY），总体而言，从小麦促生效应的表现结果上看，在株高、根长、干重和鲜重上，多菌混合接种明显优于单菌接种，其中处理N+P与多菌混合组PY、NPY和N+P与单菌接种组各处理之间差异显著（P<0.05）。单菌接种与多菌混合接种各处理组均高于对照组，差异显著（P<0.05）。在株高上，单菌接種与对照组相比较分别增加了8.13%、13.54%、16.04%、22.61%、31.06%和31.69%，差异显著（P<0.05）。多菌混合接种与对照组相比增加幅度为21.08%～40.46%（分别为40.76%、21.08%和24.49%），差异显著（P<0.05）。在干重上，单菌接种与对照组相比增加幅度为10.20%～41.33%（分别为16.84%、10.20%、10.20%、41.33%、1990%和11.22%），差异显著（P<0.05）。多菌混合接种与对照组相比增加幅度为28.06%～5255%（分别为28.06%、28.06%和52.55%），差异显著（P<0.05）。在鲜重上，单菌接种与对照组相比增加幅度为18.18%～27.27%（分别为22.73%、0、18.18%、20.45%、27.27%和18.18%），差异显著（P<0.05）。多菌混合接种与对照组相比增加幅度为20.45%～65.91%（分别为65.91%、31.81%和20.45%），差异显著（P<0.05）。在叶绿素含量这一参数上，单菌接种与对照组相比较增加幅度为16.13%～35.19%（分别为28.49%、16.13%、27.43%、34.84%、35.19%和26.16%），差异显著（P<0.05）。多菌混合接种与对照组相比增加幅度为17.19%～34.14%（分别为34.14%、27.96%和17.19%），差异显著（P<0.05）。从总体来看，单菌接种与多菌混合接种均对小麦生长有一定的促生效果，多菌混合接种明显优于单菌接种对小麦的促生效应。但从某些促生效果来看，单菌接种的效果却高于多菌混合接种，如菌株N3接种过后的小麦叶绿素含量增加了38.0%，而处理PY混合接种的叶绿素含量才增加了36.2%，其他指标也有类似结果，其各项促生指标均高于其他单菌接种处理组的效果，差异显著（P<0.05）。小麦促生长状况如图3所示。

3 讨论与结论

本研究從巨菌草根部样品中筛选出了11株促生能力较强的菌株，发现具有溶磷能力的有6株，产IAA的有3株。通过盆栽试验表明，IAA产生量、溶磷能力对小麦的株高、根长、鲜重、干重和叶绿素含量等有明显的促生效应。小麦的生长指标（株高、根长、鲜重、干重等）与促生菌的产氨能力、溶磷能力、产IAA能力之间呈正相关关系。这表明通过接种促生菌株来提高植物的生物量是一个非常有效的途径，对农业实际生产具有积极作用。

内生细菌通过解磷（Paul & Sundararao，1997）、分泌植物激素（罗菲等，2011）、促进植物对矿质元素的吸收（史应武，2005）等途径促进植物生长。关于促生菌株在实际生产中的应用效果已有文献报道，如邓振山等（2012）的研究结果表明在株高、根长和干重方面与对照组的比较分别增加了30.14%、81.10%和33.33%;常慧萍等（2016）分别用HN1202、HP1218、HK1216菌液对小麦种子进行浸种处理，小麦幼苗根长分别较对照（无菌液处理）显著增加12.6%、20.4%、17.5%，株高分别较对照显著增加11.8%、13.2%、8.8%;朱培淼等（2007）的研究结果表明在株高和鲜重方面与对照组比较分别增加了33.7%和97.7%。本研究中，通过盆栽试验对筛选到的11株促生菌株进行促生能力测定，结果显示多菌混合接种对小麦的促生效应在株高、干重、鲜重和叶绿素含量上较对照组分别增加了24.49%、31.84%、28.06%和34.14%。从总体上来看，多菌混合接种明显优于单菌接种对小麦的促生效应，混合菌株中各菌株间通过协同作用充分发挥其促生效果，此结果与常慧萍等（2016）和朱培淼等（2007）的结果一致。但单从某些方面来看，存在单菌接种的促生效果要高于多菌接种，发生这种现象的可能原因是由于多菌混合后产生了某种物质，从而抑制了菌株产生的促生长因子发生效应。当然，影响内生菌促进小麦生长的因素是比较复杂的，既有溶磷、分泌IAA，也有固氮、吸收营养物质、分泌维生素、赤霉素、细胞分裂素等因素的影响，以及各个因素间的相互影响（庞发虎等，2016）。本研究筛选得到的菌株具有多种促生能力（包括固氮、产IAA和溶磷等），通过盆栽试验证实菌株N-01、N-02、YB-07和P-03对小麦的促生效果显著，但还需在田间对各菌株的定殖能力、促生能力和复合菌株中的优势促生菌进一步验证与探究。此外，单菌接种的促生效果低于多菌混合接种的促生效果，在这些菌株的应用过程中如何进行科学、合理地组合进而在大田试验中发挥出更好的效果，尚需进一步研究。

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（责任编辑 蒋巧媛）