HPLC-DAD法测定狭叶金粟兰不同部位中绿原酸、伞形花内酯和异嗪皮啶的含量

冯云霞，戢太阳，冯协和，刘 菁

0 引言

狭叶金粟兰(ChloranthusangustifoliusOliv)为金粟兰科(Chloranthaceae)药用植物之一[1]，又名“四块瓦”、“小四块瓦”或“四叶对”等[2]，最早见于清代的《植物名实图考》。狭叶金粟兰在不同的地区以全草或根茎入药，其具有活血散瘀、消肿解毒的功效，临床上多用于治疗风湿性关节炎和菌痢等[3]。狭叶金粟兰的化学成分[4]主要有二聚倍半萜类化合物、单倍体倍半萜类化合物、香豆素类、酰胺类，其提取物具有抗菌[5]和杀虫[6]作用。研究证明，香豆素类成分是金粟兰科植物发挥抗菌消炎作用的主要成分[7]，伞形花内酯和异嗪皮啶即是狭叶金粟兰香豆素类成分中的2种。被《中国药典》收录的狭叶金粟兰同科药材肿节风还将异嗪皮啶作为含量测定的指标之一[8]。目前对于狭叶金粟兰的研究较少，主要是成分研究和药理活性研究[9-11]，对其质量控制尚缺乏相关研究。本试验建立了HPLC-DAD法测定狭叶金粟兰不同部位(根、茎、叶)中绿原酸、伞形花内酯和异嗪皮啶的含量，以期为狭叶金粟兰药材的质量控制和狭叶金粟兰资源的合理开发利用提供科学依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 UltiMate 3000型高效液相色谱仪(DIONEX)(四元梯度泵、二极管阵列检测器)，LGC-1025M型柱温箱及Chromeleon色谱数据工作站；HC1003型精密天平(上海花潮高科d=1 mg)；PTY-224型分析天平(美国普力斯特d=0.01 mg)；DFT-100型手提式粉碎机(上海新诺仪器设备有限公司，功率：400 W)；HT-9013A型电热恒温干燥箱(东莞华台测试仪器有限公司)；US-15D超声波清洗器[中科仪(北京)仪器有限公司，清洗频率：40 kHz]。

1.2 试药 狭叶金粟兰样品分别于2018年6月23日采自湖北省丹江口市六里坪镇和2018年7月14日采自湖北省竹山县上庸镇，采集的样品由湖北医药学院陈吉炎教授鉴定，确定为金粟兰科植物狭叶金粟兰ChloranthusangustifoliusOliv。绿原酸对照品(批号：101023-201705，纯度：99.15%，上海融禾医药科技发展有限公司)、伞形花内酯对照品(批号：101402-201609，纯度：99.2%，中国药品生物制品检定所)、异嗪皮啶对照品(批号：110821-201501，纯度：98.77%，中国药品生物制品检定所)；乙腈(色谱纯，天津赛孚瑞科技有限公司)；磷酸(分析纯，南昌瑞铃化工有限公司)；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 样品预处理 狭叶金粟兰样品在采集时要求选取的植株生长年限一致，采集时要保证植株完好。将采集到的样品植株的根、茎和叶分离，每3个单株作为一个样品，共得到根、茎和叶样品各6份，分别编号为狭叶金粟兰根01～06号样品、狭叶金粟兰茎01～06号样品、狭叶金粟兰叶01～06号样品。将得到的样品清除杂质，于鼓风干燥箱中干燥，用粉碎机粉碎并过60目筛、备用。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 分别精密称取绿原酸、伞形花内酯和异嗪皮啶对照品适量，用甲醇溶解后制成质量浓度分别为0.368 7、0.016 7、0.054 3 mg/ml的溶液，用0.22 μm滤膜过滤，滤液即为混合对照品溶液，用封口膜封口，置冰箱(2～5 ℃)中保存。

2.2.2 供试品溶液的制备 取预处理后的狭叶金粟兰根、茎和叶粉末样品2 g，精密称定，置圆底烧瓶中，精密加入75%甲醇50 ml，采用加热回流法提取1 h，放冷后再次称定质量，用甲醇补足减失的质量。补足重量后摇匀，滤过，再取续滤液，用0.45 μm滤膜过滤，即得。

2.3 色谱条件及系统适应性试验 色谱柱：Phenomenex C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B)，进行梯度洗脱：0～9 min，12%～20%A；9～15 min，20%～25% A；15～25 min，25%～35% A；25～45 min，35%～45% A，45～60 min，45%～20%A；流速：1.0 ml/min；检测波长330 nm；柱温30 ℃；进样量20 μl。

在上述色谱条件下，进样“2.2.1”项下混合对照品溶液及“2.2.2”项下狭叶金粟兰根01号供试品溶液。结果显示，绿原酸保留时间约为8.34 min；伞形花内酯保留时间约为14.76 min；异嗪皮啶保留时间约为32.05 min；理论塔板数均不低于7 000；供试品色谱峰的DAD匹配值不低于999.13，说明供试品溶液中的绿原酸、伞形花内酯和异嗪皮啶色谱峰与其相邻的色谱峰分离较好。见图1。

图1 混合对照品与供试品HPLC图注：A.混合对照品，B.供试品；1.绿原酸，2.伞形花内酯，3.异嗪皮啶

2.4 线性关系考察 精密吸取“2.2.1”项下混合对照品溶液，分别用甲醇稀释成含绿原酸6.144 7、7.373 6、9.217 0、12.289 3、18.434、36.868 μg/ml，伞形花内酯0.278 7、0.334 4、0.418 0、0.557 3、0.836 0、1.672 0 μg/ml，异嗪皮啶0.904 7、1.085 6、1.357 0、1.809 3、2.714 0、5.428 0 μg/ml系列对照品溶液。按“2.3”项下色谱条件进样分析，进样量20 μl，记录峰面积。以对照品的浓度为横坐标(X)，绿原酸、伞形花内酯和异嗪皮啶峰面积为纵坐标(Y)，绘制此3种成分的标准曲线，得绿原酸、伞形花内酯和异嗪皮啶的回归方程。其线性范围、回归方程和相关系数结果见表1。

表1 绿原酸、伞形花内酯和异嗪皮啶回归方程和线性范围

2.5 精密度试验 精密吸取“2.2.1”项下含绿原酸0.368 68 mg/ml、伞形花内酯0.016 7 mg/ml、异嗪皮啶0.054 3 mg/ml的混合对照品溶液，按“2.3”项下色谱条件进样测定，测定次数为6次，记录绿原酸、伞形花内酯和异嗪皮啶的峰面积。测定结果显示，绿原酸、伞形花内酯和异嗪皮啶峰面积的RSD分别为1.28%、1.16%和1.37%，均在2%范围内，说明仪器精密度良好。

2.6 重复性试验 称取狭叶金粟兰根01号样品、狭叶金粟兰茎02号样品、狭叶金粟兰叶05号样品各6份，每份2 g，准确称定后制备供试品溶液，制备方法如“2.2.2”项下所述，经0.45 μm滤膜滤过后按“2.3”项下的色谱条件进样测定，进样量20 μl，记录绿原酸、伞形花内酯和异嗪皮啶的峰面积。结果显示，按含量计算，狭叶金粟兰根中绿原酸、伞形花内酯和异嗪皮啶的RSD分别为1.19%、1.14%、1.35%，狭叶金粟兰茎中绿原酸、伞形花内酯和异嗪皮啶的RSD分别为1.41%、1.37%、1.18%，狭叶金粟兰叶中绿原酸、伞形花内酯和异嗪皮啶的RSD分别为1.27%、1.33%、1.52%，说明该方法重复性良好。

2.7 稳定性试验 取狭叶金粟兰根01号样品、狭叶金粟兰茎01号样品、狭叶金粟兰叶01号样品各2 g，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，经0.45 μm滤膜滤过后，分别于0、1、2、3、6、9、12、24、48 h按“2.3”项下的色谱条件进样测定，记录绿原酸、伞形花内酯和异嗪皮啶的峰面积。结果显示，狭叶金粟兰根中绿原酸、伞形花内酯和异嗪皮啶峰面积的RSD分别为1.48%、1.27%、1.16%，狭叶金粟兰茎中绿原酸、伞形花内酯和异嗪皮啶峰面积的RSD分别为1.31%、1.27%、1.48%，狭叶金粟兰叶中绿原酸、伞形花内酯和异嗪皮啶峰面积的RSD分别为1.54%、1.22%、1.65%，说明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.8 加样回收率试验 取狭叶金粟兰根01号样品6份，每份2 g，精密称定，置圆底烧瓶中，精密加入75%甲醇50 ml，再加入含绿原酸、伞形花内酯和异嗪皮啶质量浓度分别为0.368 7、0.016 7、0.054 3 mg/ml的混合对照品溶液1.0 ml，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，经0.45 μm滤膜滤过后，按“2.3”项下的色谱条件进样测定，计算加样回收率及RSD，结果见表2。

表2 加样回收率结果(n=6)

2.9 样品含量测定 分别称取狭叶金粟兰根01～06号样品、狭叶金粟兰茎01～06号样品、狭叶金粟兰叶01～06号样品各2 g，准确称定后制备供试品溶液，制备方法如“2.2.2”项下所述。制备好的供试品溶液按“2.3”项下的色谱条件，测定绿原酸、伞形花内酯和异嗪皮啶的峰面积，根据标准曲线计算含量。测定结果见表3。

表3 狭叶金粟兰不同部位中绿原酸、伞形花内酯和异嗪皮啶的含量(μg/g)

3 讨论

3.1 检测波长的确定 二极管阵列检测器(DAD)具有灵敏度高、噪音低、线性范围宽等优点。《中国药典》中异嗪皮啶的最大吸收波长为342 nm，而绿原酸的最大吸收波长为330 nm，伞形花内酯的最大吸收波长为327 nm，试验中对绿原酸、伞形花内酯和异嗪皮啶对照品溶液进行扫描，发现在330 nm波长下绿原酸、伞形花内酯和异嗪皮啶均有灵敏度高的较强吸收，故最终决定检测波长330 nm。

3.2 流动相的确定 流动相体系和流动相比例对所分析成分与相邻峰的分离效果有主要影响。根据文献[12-16]，本试验分别探索了乙腈-0.1%磷酸溶液和甲醇-0.1%磷酸溶液作为流动相下，各成分的分析效果，结果发现，乙腈-0.1%磷酸溶液流动相对狭叶金粟兰样品的分离效果要更好。但以乙腈-0.1%磷酸溶液作为流动相进行分离时仍存在绿原酸和相邻的杂质峰分离不好的情况，故本试验又尝试了改变乙腈和0.1%磷酸溶液的比例，采用梯度洗脱，并通过调节流速，控制柱温，最终将绿原酸和相邻的杂质峰进行了很好的分离。故最终确定了流动相为乙腈-0.1%磷酸溶液，并按“2.3”项下条件进行梯度洗脱。

3.3 提取方法的选择 本试验为了更好地提取狭叶金粟兰根、茎、叶中的绿原酸、伞形花内酯和异嗪皮啶，通过参考文献[17-19]，对这3种成分的提取方法进行了探索，课题组分别对比了索氏提取法、超声提取法和加热回流法的提取效率，结果发现，加热回流法提取的绿原酸、伞形花内酯和异嗪皮啶含量较另2种方法更高。确定提取方法后，课题组又探索了提取时间(0.5、1、1.5、2、2.5 h)、料液比(1∶10、1∶25、1∶50、1∶75、1∶100)对提取效率的影响。结果显示，狭叶金粟兰3个部位的提取方法都可以确定为：加热回流法，75%甲醇作为溶剂，提取时间为1 h，料液比为1∶25。

3.4 含量测定结果 通过狭叶金粟兰各部位中绿原酸、伞形花内酯和异嗪皮啶的含量测定结果可知，狭叶金粟兰根中的绿原酸、伞形花内酯和异嗪皮啶含量最高，分别为184.34 μg/g、8.36 μg/g和27.14 μg/g。狭叶金粟兰各部位中这3种成分的含量趋势为：根>茎>叶，此结果与袁琴琴等[14]研究的同属植物银线草不同部位异嗪皮啶含量的差异相同，但各部分含量差异不及其研究结果中的差异之大。狭叶金粟兰作为药材使用时，不同地区使用的部位不同，有些地区以全草入药，有些地区以根茎入药，本测定结果说明，狭叶金粟兰药材中的绿原酸、伞形花内酯和异嗪皮啶以根中最多，在使用狭叶金粟兰时，可对其不同部位的药理活性和临床应用进行区别，以达到最好使用的效果。

4 结论

本试验研究建立了HPLC-DAD法测定狭叶金粟兰不同部位中绿原酸、伞形花内酯和异嗪皮啶含量的方法，通过HPLC对狭叶金粟兰不同部位中绿原酸、伞形花内酯和异嗪皮啶含量进行了测定，结果显示，狭叶金粟兰不同部位中绿原酸、伞形花内酯和异嗪皮啶的含量次序为：根>茎>叶。试验建立的方法简便快捷、准确可靠，专属性强，重现性高，可为狭叶金粟兰药材的资源开发和利用提供参考依据。