百草枯中毒致小鼠肺纤维化模型的建立

王 萍，李铁刚

0 引言

百草枯(PQ)是一种杂环类有机速效除草剂，广泛应用于农业，对人类和动物都有剧毒，致死率高达70%[1]。在全球范围内，每年有250 000～370 000人死于农药中毒[2]，其中，因PQ中毒导致的死亡已经成为中毒患者的主要死因。这也成为一些国家尤其是发展中国家面临的一个重要公共卫生问题[3-5]。临床研究显示，中毒患者肺部PQ浓度是血浆中浓度的6～10倍[6]，早期可表现为急性肺损伤及不同程度的急性呼吸窘迫综合征，肺泡细胞受损严重[7-8]，肺组织过度修复。百草枯通过中性氨基酸转运蛋白到肺部[9]，继而发生不可逆性和广泛性的肺纤维化，最终导致较高的死亡率[10]。目前，尚无有效的药物可以预防和治疗纤维化的进展[11]，需要更多的临床和实验来探究中毒的机制。因此，本研究采用腹腔注射方式建立小鼠PQ中毒致肺纤维化模型，通过动物模型多方面评估其纤维化的表现，确定最佳的造模浓度，建立稳定的动物模型，为以后纤维化的机制研究打下基础。

1 材料与方法

1.1 动物与试剂 无特定病原体级别(SPF)的BALB/c小鼠(6～8周龄，雄性，18～22 g) 40只，由中国医科大学本溪研发中心实验动物部提供。在控制温度为22.2 ℃的室内，将小鼠圈养在恒定的12 h光照/12 h黑暗循环环境中。这些实验经中国医科大学动物实验伦理委员会批准(许可编号：2017PSPSK)。百草枯粉剂购自美国Sigma公司，抗α-SMA抗体和E-cadherin抗体购自Abcam公司(批号：ab5694、ab76055)。

1.2 动物分组和处理方法 PQ中毒的小鼠模型建立。腹腔注射方式染毒，方法：A组为生理盐水空白对照组；B组10 mg/kg单次染毒；C组20 mg/kg单次染毒；D组10 mg/kg隔日1次染毒。共3次。D组首次染毒后至第21天，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉处死小鼠，取双肺组织。

1.3 苏木精-伊红染色(Hematoxylin-eosin，HE染色)、马松(Masson染色)染色 将小鼠整个左肺组织用4%福尔马林固定过夜。在70%乙醇中常规脱水，并在二甲苯中澄清，制备4 μm切片用于常规梯度酒精脱水、浸蜡、包埋、切片，HE染色镜下评估肺组织病理学变化和Masson染色，用于证明胶原沉积。

1.4 Ashcroft评分 用Ashcroft半定量评分来评估小鼠肺组织纤维化程度[12]。具体评分标准：0级，正常组织；1级，支气管壁轻度增厚；2～3级，纤维化程度加重，支气管肺泡壁中度增厚；4～5级，重度纤维化改变，支气管壁结构破坏，有纤维条索或纤维团块形成；6～7级，极重度纤维化，大范围肺组织结构破坏，可伴有蜂窝肺形成；8级，满布纤维组织，整个肺组织全部闭塞坏死。

1.5 Western blot蛋白检测 取小鼠右肺组织剪碎成小块称重，放入EP管中。用提前预冷的含有蛋白酶抑制剂(PMSF)的蛋白质抽提试剂在冰上裂解肺组织后于14 000 g离心，取上清液转移入新的EP管中。用BCA法测定提取的上机检测蛋白浓度。取50 g总蛋白上样，经10%SDS-PAGE凝胶电泳分离，再转移到硝酸纤维素膜上，用5%脱脂奶粉室温封闭1 h，加入一抗孵育4 ℃过夜。辣根过氧化酶标记的二抗室温孵育l h，上机扫描检测拍照。每组实验至少重复3次。

1.6 观察指标 一般情况检测：小鼠精神状态、体重、毛发、呼吸频率、进食水量及异常行为(激惹)和小鼠的生存分析，肺组织HE染色，Masson三色染色，α-SMA和E-cadherin蛋白检测。

1.7 统计学方法 采用SPSS 24.0统计软件。采用Kaplan-Meier生存分析，采用双侧非配对t检验，与正常对照组进行比较。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 一般情况 A组(生理盐水对照组)小鼠精神状态佳，毛发光洁，鼠尾无发绀，进食水等正常，体重稳定增加；B组(10 mg/kg，单次染毒组)小鼠精神状态略可，活动略下降，呼吸无急促，体重增加缓慢，进食水正常，4～5 d后基本恢复正常状态；C组(20 mg/kg，单次染毒组)小鼠精神萎靡，体重持续下降，活动减少，易抓捕，走路不稳，口周发绀，部分小鼠于5 d后出现死亡；D组(10 mg/kg，隔日1次染毒组，共3次)小鼠精神状态极差，体重下降明显，腹泻，口周鼠尾发绀，甚至出血溃烂，毛发蓬松暗淡，头颤，前期喘息气促，点头样呼吸，个别小鼠伴随有激惹现象，后期呼吸频率下降，精神萎靡，无进食水，7 d全部死亡。

2.2 生存分析 A组和B组21 d全部存活；C组于第7天死亡率达70%，7 d后较平稳；D组第11天后全部死亡。重复实验后，C组动物模型最为稳定。见图1。

图1 小鼠的生存分析图

2.3 苏木精-伊红(HE)染色 A组肺组织结构清晰，无炎性细胞浸润，有少量出血点。B组和C组肺泡间隔增厚，淋巴细胞浸润，肌成纤维细胞增多，胶原纤维形成。D组肺泡结构紊乱破坏严重，萎缩塌陷至消失，大量炎性细胞浸润。见图2。

图2 小鼠肺组织HE染色(100×)

2.4 Masson染色 A组可见结构大致正常，仅大血管周围可见少许蓝色胶原纤维。B组可见不同程度的肺泡间隔增宽，有增生的肌纤维和胶原纤维。C组肺泡结构明显增宽，胶原纤维组织沉积较多。D组肺泡间隔及肺泡腔大面积被破坏、闭塞。组织被大量的蓝色胶原纤维填充。见图3。

图3 小鼠肺组织的Masson染色(100×)

2.5 小鼠肺组织的Ashcroft评分 PQ染毒浓度越大，小鼠肺组织损伤越重，Ashcroft评分越高。D组(10 mg/kg，隔日1次染毒组，共3次)评分最高，肺组织损伤最为严重，小鼠全部死亡。根据评分和动物临床表现综合，C组(20 mg/kg，单次染毒组)模型最佳。见表1。

表1 小鼠肺组织的Ashcroft评分

2.6 Western blot检测 A组小鼠无中毒，其肺组织无纤维化改变，其间质表达α-SMA最少。B组、C组与A组空白对照组比较，其上皮标记E-cadherin依次减少，而间质标志物α-SMA逐渐增加，以20 mg/kg单次给药组为最佳。D组隔日1次染毒，共3次，给药剂量较大。见图4。

图4 Western blot检测结果

3 讨论

百草枯是发展中国家广泛应用于农业的除草剂，其中毒发病率和自杀使用率呈逐年上升趋势[13]，且具有救治率低、死亡率高的特征，目前临床尚无有效救治药物。患者即使度过急性期，也会逐渐进展为不可逆性肺部纤维化，直至呼吸困难最终死亡[14]。近年来，关于肺部纤维化疾病的研究较多，探索纤维化相关的分子和信号通路一直是热门方向，但是发病机制一直不明确。在建立动物纤维化模型方面，研究者也采用了多种方式：有通过大鼠吸入二氧化硅建模，也有通过小鼠博来霉素滴鼻诱导[15-16]。尽管动物博来霉素诱导和百草枯致肺纤维化在表型上相似，但实际是不同的。百草枯处理过的肺部表现出明显的促成纤维细胞破坏，肺泡内纤维化和闭塞性纤维化；相比之下，博来霉素治疗首先诱导细胞脱落和肺泡崩解，然后随着肺泡壁的纤维增厚而发展为间质纤维化[17-18]。此外，有关百草枯诱导的纤维化模型较少，主要是大部分患者以急性肺损伤为主，死亡率较高，幸存者较少，且留有肺纤维化的后遗症，严重影响肺功能[19]。PQ中毒导致的非纤维化有进展快且不可逆的特点，因此，模拟患者中毒，构建稳定的纤维化模型是研究PQ中毒后纤维化机制的重要前提，进而才能寻找有效的治疗方法。

本研究通过不同剂量PQ对小鼠进行腹腔注射，从单次染毒到隔日1次染毒多种方式寻找稳定的建模染毒浓度。研究发现，注射不同剂量的百草枯，小鼠出现不同程度中毒反应。10 mg/kg单次染毒组小鼠无死亡，虽然有不同程度的肺部纤维化特征，但症状较轻。相比之下，百草枯浓度为20 mg/kg时，21 d后动物纤维化模型更为稳定，出现部分死亡，不会造成过多的数据丢失，同时21 d后存活的小鼠肺部组织产生晚期慢性炎症反应与稳定的纤维化特征，符合人中毒后慢性行为特征和死亡率[20]。进一步的肺组织病理学检查也证实，动物模型的肺泡结构破坏、消失，肺泡腔内炎症细胞浸润、肺泡间隔增厚，淋巴细胞浸润，Masson染色判断肌成纤维细胞增多，胶原纤维形成，表明纤维化模型是稳定可靠的。Ashcroft评分一直是较经典的纤维化评分，在病理专家协助下，在HE染色的基础上进行半定量评分，操作简易、客观、真实[21-22]。在建模稳定基础上，取小鼠的肺组织进一步验证上皮标记物E-cadherin和间质标志物α-SMA的表达情况，我们发现存活小鼠肺组织纤维化越严重，间质标志物α-SMA的表达越高，上皮标志物E-cadherin越低。D组隔日1次给药方式，由于剂量过大，小鼠在实验初期可能就死于急性肺损伤，肺部纤维化还没能形成，不适合纤维化模型的构建。因此，本研究通过动物重复试验，采用20 mg/kg单次腹腔注射方式染毒，观察21 d制备的方法，多方面来评估纤维化的最佳模型，为下一步纤维化进展机制和治疗打下基础。