浓醪发酵葛根酒的工艺研究

董 琪，张后才，刘飞翔，刘开放，吴文睿，方颂平

（亳州学院生物与食品工程系，安徽亳州 236800）

葛根为豆科多年生落叶藤本植物的干燥根茎，属于卫生部公布多年生豆科藤本药食两用植物，其含有丰富的淀粉、膳食纤维、氨基酸，以及对人体有益的微量元素，葛根素、大豆苷、芦丁等异黄酮类物质，具有极高的营养和药用价值，素有“南葛北参”和“南方人参”之美誉。葛根黄酮类化合物具有治疗心脑血管疾病、预防动脉硬化、抗癌、抗炎症、舒张平滑肌等多种药理作用，更值得关注的是，作为其中有效功能性成分之一的葛根素具有解酒护肝的功效[1-3]。

葛根作为提取淀粉或者黄酮的原料，没有得到充分利用。而以葛根为原料制作发酵型保健酒时，其丰富的淀粉可为酒的转化提供物质基础，异黄酮类则可为“保健”提供物质基础。葛根酒是以鲜葛根或者葛根粉为原料,经酶解糖化和酵母发酵或者直接由酒精浸提得到的一种低度酒，因其含有多种功能成分、营养全面、口感带有浓郁的葛根清香，成为深受大家喜欢的保健酒之一。由于葛根酒是一种新兴的保健酒，生产技术和生产工艺还存在酿造工艺繁琐、成品酒中的葛根素含量低、原酒苦涩味如何去除、葛根酒专门酵母的选择等问题[4]。浓醪发酵技术具有提高乙醇浓度、设备利用率高和降低能耗等优势，在酿酒领域得到较多的成功应用[5-6]。因此，采用浓醪发酵技术提高发酵型葛根酒的酒精度，较高的酒精度可增加醇溶性的葛根异黄酮含量[7]，并且较高的酒精度可抑制杂菌生长以防生酸，从而可通过后期陈酿改善口感风味。浓醪发酵葛根酒的开发可为营养保健酒的开发提供一种新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料、仪器

菌种：耐高温酿酒高活性干酵母，安琪酵母股份有限公司；食品级耐高温α-淀粉酶150000 U/g、食品级糖化酶260000 U/g，沧州夏盛酶生物技术有限公司；葛根素标准品，中国食品药品检定研究院；硫酸、氢氧化钠、酚酞、磷酸氢二钾等均购于国药；野生葛根粉、种植葛根粉购于亳州市中药材交易市场；野生葛根淀粉，购于国森源葛粉实业有限公司。

仪器设备：UV-9000S 紫外分光光度计，上海元析；HH.S21-8-S 恒温水浴锅，上海跃进；SPX-400-III 生化培养箱,上海跃进；ME204E 电子分析天平，梅特勒；H2500R-2 高速冷冻离心机，湘仪；立式高压蒸汽灭菌锅,上海博讯；PE28-pH 计，梅特勒；GZX-9240MBE 电热鼓风干燥箱，上海博讯；K9860全自动凯氏定氮仪，海能。

1.2 实验方法

1.2.1 工艺操作要点

1.2.1.1 液化

根据实验所需，准确称取粉碎过筛后的原料，并根据料液比，将所需自来水加入锥形瓶中，缓缓加入称量好的原料，边加入边搅拌，以防结团；再分别加入KH2PO40.125 g/L；用硫酸将pH 值调节至5.5，按30 U/g 原料，向瓶中加入耐高温α-淀粉酶，放入沸水浴中进行液化，每隔一定时间摇匀1 次，90 min后经碘试无蓝色，便取出。

1.2.1.2 糖化

将液化后的醪液冷却至60 ℃，调节pH4.5，按260 U/g 原料，加入糖化酶，混匀后，于60 ℃水浴锅中保温一定时间。

1.2.1.3 发酵

将糖化后的醪液冷却至30 ℃以下，按原料的0.5 ‰，加入活性干酵母，然后放于30 ℃恒温培养箱中进行培养，直至无气泡产生。

1.2.1.4 酒液的制备

发酵结束后，使用冷冻离心机，在8000 r/min，5 ℃下离心10 min，取上清酒液，用于酒精度、酸度和总黄酮的测定。

1.2.2 单因素实验

1.2.2.1 野葛全粉与野葛淀粉比例对葛根酒的影响

野葛全粉和野葛淀粉按照1∶1、1∶1.5、1∶2、1∶2.5进行调配，按淀粉含量进行换算，使调配后的淀粉含量分别为57%、63%、67%和70%，再分别调整料液比，使得发酵初始淀粉溶液浓度为20 g/100 mL，发酵结束后测定酒样酒精度和总黄酮含量。

1.2.2.2 料液比对葛根酒的影响

采用野葛全粉和野葛淀粉按照一定比例调配后，按1∶2.0、1∶1.8、1∶1.6、1∶1.4 和1∶1.2 的料液比进行处理发酵，直至无显著气泡产生，发酵结束，测定各项指标。

1.2.2.3 糖化时间对浓醪发酵型葛根酒的影响

野葛全粉和野葛淀粉按照一定比例调配后，料液比按1∶1.6，考察糖化时间0 min、15 min、30 min、45 min和60 min对发酵后葛根酒质量的影响。

1.2.3 响应面设计优化料液比和糖化酶用量

从以上实验发现糖化过程和料液比对浓醪发酵葛根酒的酒度和总黄酮含量影响较大，因此本实验采用中心组合设计（CCD）原理，以料液比和糖化酶用量为响应变量，以酒度和总黄酮含量为响应值，进行2 因素3 水平响应面分析实验。实验方案设计见表1，然后按1.2 中的实验方法进行液化，糖化工艺改为：液化结束后，降温至30 ℃，再加入不同水平的糖化酶。发酵结束后，测定各指标。

表1 中心组合设计水平及编码

1.2.4 原料成分分析

均采用国家标准方法：淀粉，GB 5009.9—2016酶水解法；蛋白质，GB 5009.5—2016 凯氏定氮法；粗脂肪，GB 5009.6—2016 索氏抽提法；灰分，GB 5009.4—2016 食品中总灰分的测定；水分，GB 5009.3—2016直接干燥法。

1.2.5 葛根总黄酮的测定

紫外分光光度法[8]。以75%vol 的乙醇将葛根素稀释至合适的浓度梯度，在250 nm 处测吸光值，制作标准曲线。酒液总黄酮的测定，采用75 %vol乙醇稀释至合适倍数后，直接测定。葛根中总黄酮的测定，采用75 %vol 乙醇，经超声提取、过滤、定容，并稀释到合适倍数后测定。

1.2.6 酒精度和酸度的测定

酒精度：密度计法[9]。酸度：10 mL酒液，以酚酞为指示剂，用0.1 mol/L NaOH 标准溶液滴定，消耗1 mL 0.1 mol/L NaOH 标准溶液为1 度。吸取酒液1 mL，加入250 mL 三角瓶中，加水50 mL，加酚酞指示剂2 滴，用0.1 mol/L NaOH 标准溶液滴定，滴定至溶液呈微红色并在30 s内不褪色为终点[10]。

2 结果与分析

2.1 葛根成分分析

野葛和粉葛均含有大量的淀粉和葛根异黄酮等功能性成分。由表2 可见，野葛和粉葛在淀粉和总黄酮上差异较大，野葛淀粉含量达到26%，粉葛淀粉含量为51%；但野葛中的总黄酮为12.7%，远大于粉葛的2.4%。该结果与有关文献报道的结果相类似[11-12]。

葛根中淀粉含量，远低于谷物，故纯葛根发酵后的酒度较低，口感较差，并且葛根素等黄酮类物质在水中的溶解度没有醇溶液的高，因此提高发酵的终酒度有利于葛根素的溶出[7，13]。为了提高酒精度，则需要提高料液比，或增加醪液的总淀粉含量。因此近些年文献报道的葛根酒，多为葛根与高粱、糯米、玉米、大米等常用酿酒原料一起混合发酵，有的则直接配入蔗糖或葡萄糖，以提高发酵的酒精度和产品的口感。但加入较高比例的谷物，会使葛根素等异黄酮类的终浓度下降。在不添加外源糖类物质葛根酒的预实验中发现，当料液比小于1∶3 进行调浆时，发现醪液较黏稠，主要原因是葛根中含有大量的纤维素，吸水性强，从而影响后续液化和糖化。因此为了从根本上解决发酵葛根酒的品质问题，获得酒精度和功能性成分含量较高的葛根酒，本实验采用野葛全粉和野葛淀粉（淀粉88.6%，葛根素≥75 mg/kg）配伍，进行浓醪发酵。

表2 野葛和粉葛主要组成成分分析 (g/100 g)

2.2 野葛全粉与野葛淀粉比例对葛根酒的影响（表3）

表3 野葛全粉和野葛淀粉比对葛根酒酒精度和葛根总黄酮的影响

由表3可知，在野葛全粉和淀粉的不同配比下，葛根酒的酒精度无显著性差异，均在13.3 %vol～13.7%vol 之间。但总黄酮含量却随野葛全粉占比的减小，从19.8 mg/mL 减少至7.4 mg/mL。这主要是由于野葛全粉中的总黄酮含量远大于其淀粉中总黄酮的含量，因此在葛根全粉占比减小时，总黄酮的含量逐渐降低。为此，在考虑配伍后的淀粉浓度的情况下，野葛全粉和野葛淀粉的配比选用1∶1。

2.3 料液比对葛根酒的影响（图1）

图1 料液比对葛根酒质量的影响

如图1 所示，随着料液比的增加，葛根酒中的酒精度略有上升，但从1∶1.8后显著降低；总黄酮含量随料液比增加而略增加，但酸度也随之增加。实验结果表明，料液比增大，可为乙醇发酵提供碳源来源，但是当增加到一定程度后，由于方法中的糖化时间较长，过大的料液比会使糖化后的葡萄糖浓度增高，初期过高的渗透压影响酵母的生长代谢，同时产生有机酸等副产物[14-15]。由于有机酸的增加，本实验中的酸度值随料液比的增大而增大。此外，由于料液比的增大，会使原料中的总黄酮浓度增大，酒液中的总黄酮浓度也随之增大。因此，糖化程度和料液比是葛根浓醪发酵的两个重要因子。

2.4 糖化时间对浓醪发酵型葛根酒的影响（图2）

图2 糖化时间对浓醪发酵型葛根酒的影响

目前许多文献中葛根糖化工艺均使醪液中的淀粉一次性均转化为可利用的还原性糖类。但对于浓醪发酵，醪液经糖化后就会增加初始糖浓度和体系渗透压，较高的渗透压会降低细胞膜中磷脂双分子层的流动性，底物难以进入细胞中，乙醇也难以扩散到胞外，糖酵解途径酶的活性也被抑制，酵母的发酵力和活性下降，抑制了乙醇的生成，同时产生副产物，从而不利于酵母的生长和乙醇的代谢[15]。边糖化边发酵工艺（SSF）可防止醪液的渗透压升高，例如李志军等[16]以玉米为原料添加20 U淀粉酶/g 原料，90～95 ℃液化，采用边糖化边发酵工艺，发酵酒度达到13.6%vol。

由图2 可知，随着糖化时间的增加，酒精度和总黄酮含量均逐渐下降，而酸度逐渐升高。在本实验料液比一定的情况下，随着糖化时间的增加，初始糖浓度逐渐增加，过高的糖浓度，使前期发酵过快，产热和产酸增大，同时会增加发酵液的渗透压，这些都会影响酵母的正常生长代谢。当液化结束时，醪液中已经含有相当浓度的单糖，因此糖化时间为0 min 时，即采用边糖化边发酵工艺（SSF），酵母依然有可利用的单糖。此后，在糖化酶的作用下，低分子量的糊精和寡糖分子逐渐被水解成单糖，从而解除了浓醪发酵过程中，初始糖浓度过高对乙醇发酵的不利影响。此外有文献表明[7]，酒精度的增加会促进酒液中总黄酮含量的增加，这主要是由于葛根异黄酮类物质更易溶于乙醇，这与本实验结果相符。

2.5 响应面设计优化料液比和糖化酶用量

从以上实验发现糖化过程和料液比对浓醪发酵型葛根酒的酒精度和葛根总黄酮含量影响较大，因此本实验采用中心组合设计（CCD）原理，实验结果见表4。

表4 响应面中心组合设计和实验结果

2.5.1 酒度响应值回归模型的方差分析

利用Dsign-expert 对表4 中的酒度值数据进行拟合得到的编码二次多项式方程为：Y=15.02-0.27A-0.14B-0.075AB-1.64A2-0.34B2（1）

由公式（1）中的系数和图3 可知，该方程的抛物面向下，该模型有最大值。采用Design-expert 对酒精度值进行多元回归分析，方差分析结果见表5。如表5 所示，该模型P 值远小于0.05，表明该模型在95 %的概率水平下是显著的；该模型的失拟项为P=0.4227，大于0.05，不显著，表明未知因素对该模型实验结果的干扰较小，不需要再引入其他的因素；且该模型的相关系数R2=0.9606，表明了酒精度值的变化有96.06 %的概率是由该模型决定的，并说明实验中酒精度的实际值与模型预测值有较高的一致性。因此，该模型较能准确的对实验结果进行预测。

图3 酒精度响应面三维图

表5 酒精度响应值的二次多项式回归模型的方差分析

2.5.2 葛根总黄酮响应值的回归模型的方差分析

利用Dsign-expert 对表4 中的总黄酮数据进行拟合得到的编码二次多项式方程为：Y=25.06+2.67A-0.58B-0.025AB-1.25A2-0.85B2（2）

由公式（2）中的系数和图4 可知，该方程的抛物面向下，该模型有最大值。采用Design-expert 对酒精度值进行多元回归分析，方差分析结果见表6。如表6 所示，该模型P 值为0.0016，远小于0.05，表明该模型在95 %的概率水平下是显著的；而该模型的失拟项P 值为0.6671，大于0.05，不显著，表明未知因素对该模型实验结果的干扰较小，不需要再引入其他的因素；且该模型的相关系数R2=0.9081，表明了酒精度值的变化有90.81 %的概率是由该模型决定的，并说明实验中酒精度的实际值与模型预测值有较高的一致性。因此，该模型较能准确的对实验结果进行预测。

图4 总黄酮响应面三维图

表6 葛根总黄酮响应值的二次多项式回归模型的方差分析

2.5.3 最优条件的确定与验证

采用Design-expert 在同时考虑酒精度和葛根总黄酮含量的情况下，得出最优条件为料液比0.63（1∶1.587），糖化酶用量为256.2 U/g，此时的酒精度预测值为14.8%vol，总黄酮预测值为25.8 mg/mL。在该最优条件下进行实验，酒精度实测值为15.2 %vol，总黄酮实测值为25.9 mg/mL，该值与预测值接近。

3 结果与讨论

在考察了野葛和粉葛基本组成成分的基础上，采用野葛全粉和野葛淀粉配伍进行浓醪发酵葛根酒的研制，以发酵后酒液的酒精度和总黄酮的含量为目标，对野葛全粉和野葛淀粉的配伍比例、料液比、糖化时间进行初步优化，并使用响应面中心组合实验确定料液比和糖化酶的用量，得到最佳工艺条件为：野葛全粉和野葛淀粉按1∶1 配比，料液比为1∶1.587，糖化酶用量为256.2 U/g，糖化时间为0 min时，酒精度为15.2 %vol，总黄酮为25.9 mg/mL，在此条件下，酒精度和总黄酮含量均较高。

野葛和粉葛在淀粉和总黄酮含量差异较大，其中野葛的总黄酮含量远高于粉葛，在制备葛根产品时，应根据实际需要选用合适的品种。为了获得活性成分高的葛根酒，应选用野葛进行发酵。为了克服野葛全粉中淀粉含量低的缺陷，采用与野葛淀粉配伍使用，进行发酵，取得较好结果。料液比和糖化程度对葛根酒的酒精度和总黄酮含量影响较大。其中，料液比过大时，虽然一定程度上可提高总黄酮的含量，但过高时，由于醪液过于浓稠，初始糖浓度大，渗透压高，反而不利于发酵。当糖化时间为0 min，即采用边糖化边发酵工艺后，可显著解决葛根浓醪发酵过程的这一问题。并采用响应面中心组合设计，对料液比和糖化酶的用量做出了更为精确的优化，取得较好效果。但野葛中含有大量的纤维素成分，该成分很大程度上阻碍了葛根酒的酒精度和总黄酮含量的提升，因此在发酵过程中可对去除或转化纤维素进一步研究。