基于1H-NMR 研究齐刺法对急性胃黏膜损伤小鼠代谢的影响

韩 严，杨宗保，程燕彬，陈宝华，黄婉仪，王 超*

（1.湖南中医药大学针灸推拿学院，湖南 长沙410208；2.厦门大学医学院中医系，福建 厦门361005；3.福建中医药大学针灸学院，福建 福州350000）

胃黏膜损伤与多种疾病相关，根据其临床表现，中医学多认为与“胃脘痛”“呕吐”等相关，是消化系统常见病，进一步发展可导致胃黏膜溃疡、坏死和腺体萎缩、穿孔、癌变等恶性病变，更是多种严重胃肠疾病的始动病理环节[1]。胃黏膜损伤具有高发病率、高复发率等特点，是临床的棘手问题，而且在损伤后局部或者整体出现氨基酸、糖和脂质等代谢紊乱，甚至衍生出其他脏腑疾病，例如肝胆炎症。近些年，电针治疗胃黏膜损伤[2]相关报道较多。研究表明[3]中医电针胃经穴对胃运动、胃相关外周神经、胃分泌等皆能起到显著调节恢复作用。齐刺法是一种传统的针刺手法，其操作特点是：病变部位的正中直刺一针，再在其左右（上下）各斜刺（直刺）一针。由于三针齐下，故名为齐刺，又叫做三刺。它具有增强疏通经络、行气止痛的功效，对于急性病症具有加强治疗作用的效果。

代谢组学是针对生物或细胞所有代谢物进行定量和定性分析的学科，它从机体的整体代谢状态观察生物体生理和病理代谢产物的变化[4]，与中医学整体观念相契合，是一种新兴的代谢检测技术手段。代谢组学研究方法种类很多，常用的包括气相色谱-质谱联用技术（GC/MS）、液相色谱-质谱联用技术（LC/MS）、核磁共振（NMR）[5]技术，其中NMR 技术是通过将液态生物样品置于高磁场环境中，获得代谢物的峰，通过分析峰归属以及峰值可确定代谢物的种类与含量[6]，是研究代谢组学最常见的分析工具。

足三里为足阳明经的下合穴，且足阳明经是后天之本，气血生化之源，多气多血，与胃腑关系密切。三阴交为足太阴、足少阴、足厥阴经交会穴，为临床常用穴。足太阴脾经与足阳明胃经互为表里经，燥湿相济，升降相因，在功能上相辅相成。本论文研究齐刺足三里穴对急性胃黏膜损伤小鼠的代谢影响及促进胃黏膜损伤修复的分子机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF 级雄性KM 小鼠24 只，鼠龄6～8 周，体质量18～22 g 购自吴氏实验动物中心，实验动物合格证号：SCXK(京)2014-0004。在厦门大学实验动物中心适应性饲养1 周后进行实验，饲养室温度（20±2） ℃，相对湿度（65±5）%，自然光暗周期。整个实验过程获得厦门大学实验动物伦理委员会的批准，并且符合国家科技部发布的《关于善待实验动物的指导性意见》[7]操作规范。

1.2 分组与处理

按照随机数字表法将24 只小鼠分为正常组、模型组、足三里组、三阴交组，每组6 只。 适应性饲养1周后，进行造模。造模成功后，足三里组和三阴交组用鼠板固定并分别电针（4 Hz，50 Hz）足三里穴和三阴交穴，穴位定位参考实验针灸学和模拟人体经络穴位的动物穴位定位法[8]。使用汉医牌一次性无菌针灸针（0.18 mm×13 mm）行齐刺法，深度约为5 mm，连接电针治疗仪，两组极线分别接一侧的足三里穴或三阴交穴。采用疏密波（疏波时间5 s，密波时间10 s，负载电压2～4 V，脉冲宽度0.5 ms，疏波4 Hz，密波50 Hz），强度以毫针针体出现轻微震颤为度，电针时间30 min。正常组和模型组用鼠板固定30 min。所有干预每日1 次，共7 d。

1.3 造模方法

采用国际公认的束缚-冷浸法[9]建立急性胃黏膜损伤模型。 造模前将小鼠禁食不禁水24 h，然后固定在鼠板浸入水箱中，水位浸没剑突位，水箱温度保持在20 ℃，10 h 后解除束缚冷浸。预实验小鼠予以断头处死，摘出全胃，沿胃底剪开暴露胃腔，肉眼明显可见黏膜潮红色充血、多处斑点状糜烂，光镜下可见黏膜缺损、炎性细胞浸润、上皮细胞脱落，则说明模型复制成功[10]。

1.4 样本采集与处理

标本采集之前，各组小鼠均禁食不禁水24 h，之后予以10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）腹腔注射麻醉，置于冰层上，迅速剖开腹腔，取出全胃，沿胃大弯剪开，使用0.9%生理盐水清洗，于冰层上平铺展开，以片状斑点糜烂为中心剪出2 cm×2 cm 组织块，放入4%多聚甲醛中固定24 h。剩余胃体分别快速投放液氮桶中，之后一并移入－80 ℃冰箱保存。

1.5 观察指标与方法

1.5.1 光镜观察胃黏膜 于－80 ℃冰箱中取出2 cm×2 cm 组织块并在－20 ℃冰箱中解冻，之后置于冰层上将其修剪为1 cm×0.5 cm 大小，常规石蜡包埋、切片、烘干，依次经过二甲苯、梯度酒精、伊红、苏木精染色并清洗多余染料，均匀涂抹中性树胶，覆以盖玻片，于光镜下查看。

1.5.2 代谢组学检测胃黏膜组织 于－80 ℃冰箱中取出组织块并在-20 ℃冰箱中解冻，之后置于冰层上，电子天平称取（100±10） mg 组织放入1.5 mL 无菌微量离心管（EP 管）中，充分剪碎后加入300 mL双蒸水（ddH2O）和600 mL 甲醇，涡旋混合30 s，匀浆器将组织块均碎，随后加入300 mL 氯仿，涡旋30 s，超声5 min，离心（15 min，1 3000 r/min，4 ℃），取上清液650 μL 移入1.5 mL 新的EP 管中，全程均在碎冰层中操作。之后于氮吹仪中浓缩完全干燥加入内含0.015%总悬浮颗粒（TSP）的重水（D2O）溶液600 μL，避免晃动，取500 μL 溶液移至干燥的5 mm NMR 管中，盖好橡胶圈，送至Bruker 600 MHz 光谱仪，采用Carr-Purcell-Meiboom-Gill（CPMG）脉冲序列；具体扫描参数设置为：谱宽12.019 kHz，弛豫时间320 ms，扫描次数64 次，Fid 转换LB＝0.3 Hz，PW＝30 ℃（12.7 μs），RD＝1.0 s。所有代谢物均按照人类代谢组数据库（http：//www.hmdb.ca/）查找。

1.6 统计学分析

通过MestReNova V9.0.1软件（Mestrelab Research,Santiago de Compostella,西班牙）对组织样品所有核磁共振氢谱技术（1H-NMR）谱图进行基线矫正和相位调整。以0.0 ppm 处的TSP 单峰作为参考，随后对所有谱图进行峰对齐，移除δ 4.67～4.95 ppm 段以排除水的影响，谱图以0.01 ppm 的步长在δ 0.76～8.99 ppm 的区域内进行积分，并将每个谱的积分值进行归一化，然后将归一化数据导入SIMCA-P 14.1软件中进行多元统计分析。先用主成分分析（PCA）对所有组别进行直观的组间分离，然后用正交偏最小二判别分析（OPLS-DA）最大化组间差异。同时，OPLS-DA 模型通过模型适应性（R2）和预测能力（Q2）的参数来评估，并使用S-plot 图分析潜在的变量。最后，根据样本OPLS-DA 模型变量的重要性（VIP≥1）以及t 检验（P＜0.05）获取潜在的生物标志物。

2 结果

2.1 小鼠胃黏膜组织病理学观察

正常组小鼠胃黏膜上皮完整，上皮细胞排列整齐，腺体排列紧密，形状大小正常，未见溃疡性损害(图1-C)。 模型组小鼠胃黏膜出现明显溃疡灶，黏膜细胞稀疏甚至出现空洞，大量细胞坏死、脱落，腺体排列紊乱，大部分腺体结构被破坏，其间有大量炎性细胞浸润，组织间存在明显充血与水肿(图1-M)。足三里组小鼠胃黏膜结构明显改善，腺体结构清晰，排列整齐，组织间仍有少量炎性细胞浸润，无明显充血及水肿(图1-Z)。 三阴交组小鼠胃黏膜结构略有改善，但仍有部分胃黏膜脱落，腺体结构排列紊乱，其间仍可见炎性细胞浸润，组织充血及水肿（图1-S）。

2.2 胃组织代谢物表达

2.2.1 胃组织1H-NMR 谱图表达 胃组织典型1HNMR 谱图如图2 所示。谱图中的主要代谢物是根据人类代谢组学数据库（HMDB：http：//www.hmdb.ca/）、已经发表的文献以及本课题组前期所积累的数据库所确定的，共鉴定出17 种主要标志代谢物。见表1。

2.2.2 胃组织代谢轮廓分析 由于1H-NMR 谱图的复杂性，肉眼观察各组之间差异并不明显，因此，为了对各组数据的差异做出更好评估，使用OPLSDA 对各组数据进行聚类分析，用来寻找正常组与模型组、模型组与足三里组、足三里组与三阴交组之间可能存在的变量。在胃组织的代谢样本中，可以直观地看出各组之间具有明显的离散，如图3-A所示，其中模型组与正常组分散比较明显，在图3-B和图3-D 中两组之间分离程度明显，在图3-C 中模型组与三阴交组并未表现出明显分离。

图1 小鼠胃黏膜病理组织情况（HE 染色）

图2 小鼠胃黏膜17 个代谢物1H-NMR 谱图

表1 小鼠胃组织1H-NMR 谱图所含主要标志代谢物

本研究共发现17 个内源性差异代谢物，其中胆碱、乙醇胺、甘油、丙氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺在各组的表达量发生明显变化。 采用S-plots 分析及t 检验进行进一步的比较分析，相对应的S-plots 图见图4。 结果发现与正常组相比，模型组胆碱、乙醇胺含量增加（P＜0.05），甘油、丙氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺含量减少（P＜0.05）（见图4-a）；与模型组小鼠相比较，足三里组胆碱、乙醇胺含量减少（P＜0.05），甘油、丙氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺含量增加（P＜0.05）（见图4-b）；与模型组比较，三阴交组胆碱、乙醇胺减少，甘油、丙氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺含量增加，但差异均无统计学意义（P＞0.05）。 足三里组与三阴交组比较，胆碱、乙醇胺含量减少（P＜0.05），甘油、丙氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺含量增加（P＜0.05）。 从表2 各组小鼠差异代谢物的VIP 值和P 值可以看出6 种特征代谢物在不同组别比较中的差异性，模型组与三阴交组的差异无统计学意义（P=0.762），在图4-c 中也有体现。

3 讨论

胃黏膜损伤是一种多因素、多途径参与的临床常见疾病，是一系列神经-内分泌异常改变引起胃壁屏障保护作用减弱和损伤增加的结果。针灸学是中医学的重要分支，针灸治疗胃黏膜损伤具有疗效明显、不良反应少等特点[11]。本课题前期研究证明电针胃经穴能有效促进胃黏膜的损伤修复[12]。

表2 各组小鼠差异代谢物VIP 值和P 值比较

图3 胃黏膜组织1H-NMR 代谢轮廓的OPLS-DA 得分图

图4 小鼠相对应S-plots 图

“十二刺法”中的第4 种刺法称作“齐刺”。 《灵枢·官针》：“四曰齐刺，齐刺者，直入一，傍入二，以治寒气小深者。或曰三刺，三刺者，治痹气小深者也。”齐刺法多针作用于患处，增强针感，促进经络感传，达到比单针此法更为显著的效果[13]。

谷氨酸是机体神经系统中一种含量最丰富的快速兴奋性神经递质，谷氨酰胺则是谷氨酸类神经递质的前体[14]，同时谷氨酰胺在维持胃肠黏膜的完整性中起着重要的作用[15]。甜菜碱又称三甲基甘氨酸，存在于细胞内，维持蛋白质结构稳定和细胞膜完整性并且对脂质代谢具有突出调控作用[16]，胆碱是甜菜碱合成的主要来源，是构成生物细胞膜的重要组分，具有维持细胞膜完整性及细胞信号传导功能[17]。甘油是在脂肪中形成脂肪酸的骨架，甘油可以转化为葡萄糖，为细胞提供能量，当身体有储存的脂肪作为能量时，甘油和脂肪酸就会释放出来[18]。丙氨酸参与葡萄糖-丙氨酸循环，在哺乳动物中，肌肉及其他组织分解氨基酸作为能量时，氨基会以谷氨酸的形式收集，并在丙氨酸氨基转移酶的作用下形成丙氨酸，丙氨酸被输送至肝脏，参与糖异生，形成葡萄糖，再次输送至其他组织[19]。 乙醇胺是卵磷脂的重要组成部分，与细胞膜的组成有关[20]。 在该实验中，造模之后，胆碱和乙醇胺在模型组含量明显上调，而甘油、谷氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺含量明显下调，考虑急性应激破坏细胞膜完整性所致。 大量的胆碱和乙醇胺游离在组织液中，而甘油、丙氨酸、谷氨酸和谷氨酰胺因无法继续参与膜内代谢故含量下降。干预结束后，胆碱和乙醇胺在足三里组含量明显下调，而甘油、谷氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺含量明显上调，考虑齐刺法电针足三里后联动神经-内分泌调节机制，加快神经递质的传导，促进胃黏膜内血流加速，一定程度上促进了细胞的修复，重塑黏膜组织所致。通过对三阴交组代谢物变化趋势的横向纵比较发现，虽然其差异无统计学意义，但从侧面提示针刺脾经穴也可对急性胃黏膜损伤具有一定修复意义，后期应当加以补充实验探究脾经穴对胃运动修复的作用，并探明信号通路转导。

综上所述，齐刺胃经穴可有效促进急性胃黏膜损伤修复。胃组织的代谢组学研究发现，急性胃黏膜损伤会影响机体的神经递质、氨基酸等代谢物表达水平。但是各相关差异物的信号通路以及彼此之间的代谢是否有影响关系目前尚不清楚，因此，相关的信号转导和通路研究是课题组今后的努力方向。