细胞外基质金属蛋白酶诱导因子与尿激酶型纤溶酶原激活物在载脂蛋白E敲除大鼠动脉粥样硬化斑块表达的意义及相关性*

郝启萌 纪兆乐 任 何 王 彬 张 薇 汪 洁

（空军军医大学唐都医院心内科，西安 710000）

动脉粥样硬化以脂质代谢障碍为病变基础，是多种心血管疾病的主要病理基础，对其机制的探究是防治心血管疾病的关键[3-5]。现代分子生物学研究指出，动脉粥样硬化与血管内皮细胞、平滑肌细胞、巨噬细胞等促炎症细胞密切相关，巨噬细胞吞噬脂质形成泡沫细胞，泡沫细胞进一步聚集形成坏死核心，促进动脉粥样硬化进程[8-9]。载脂蛋白E（apolipoprotein E，ApoE）基因敲除大鼠纤维斑块的形成与人类极其相似，可模拟人类动脉粥样硬化病理表现[10]。细胞外基质金属蛋白酶诱导因子（extracellular matrix metalloproteinase-inducible factor，EMMPRIN）是一种能够影响基质金属蛋白酶家族表达水平的生物因子，临床研究指出该因子会对动脉粥样硬化斑块稳定性产生影响。尿激酶型纤溶液原激活物（μPA）是纤溶酶原的重要组成部分，临床研究指出该因子具有一定加快动脉粥样硬化斑块进程的作用[11-12]。本研究探讨EMMPRIN 及μPA 在ApoE 敲除大鼠主动脉粥样硬化斑块进展过程中的表达水平变化以及两者之间的相关性，以期明确 EMMPRIN 和μPA 与动脉粥样硬化斑块形成和进展的关系。

1 材料和方法

1.1 实验动物及分组

选取8 周龄的ApoE 基因敲除雄性大鼠80 只（购自北京实验动物研究中心），按照随机数字表法将其均分为高脂饮食组与对照组（每组各40 只大鼠），高脂饮食组大鼠体质量320～351 g，平均体质量（336.23±12.03）g，对照组大鼠体质量321～349 g，平均体质量（335.29±12.11）g，2组大鼠一般资料差异不具有统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

1.2 干预方法

2 组大鼠均饲养于常规环境下，高脂饮食组给予高脂饮食（普通大鼠饲料+21%猪油+0.15%胆固醇）喂养，对照组大鼠予以正常饮食喂养，2 组大鼠喂养时间均为18 周，并分别于喂养第6、10、14、18 周时处死10 只大鼠，取主动脉弓浸于4%多聚甲醛，备做H-E 染色；同时取主动脉至腹主动脉血管-70℃保存，备做免疫印迹和RT-PCR 检测。

1.3 观测指标及评测标准

行主动脉石蜡切片，观察喂养不同时间主动脉粥样硬化斑块的形态。主动脉标本研磨后采用光密度比值法检测EMMPRIN 及μPA 的mRNA 表达，采用蛋白提取和免疫印迹分析EMMPRIN 及μPA 蛋白表达情况。

1.4 统计学处理

使用SPSS16.0 对采集的数据实施分析，计数资料以率（%）表示，采用χ2检验，计量资料以±s表示，采用t检验；两变量相关性采用Pearson相关分析。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 主动脉粥样硬化斑块病理学变化

检测分析显示，喂养至6 周时，对照组及高脂饮食组大鼠主动脉均无动脉粥样硬化斑块出现，高脂饮食组可见极少量的脂质条纹形成；喂养10 周时，对照组大鼠主动脉无动脉粥样硬化斑块形成，但高脂饮食组大鼠主动脉可见动脉粥样硬化斑块形成，且出现明显增厚的内膜、中膜，并发少量的纤维帽；喂养至18 周时，对照组大鼠主动脉可见少量动脉粥样硬化斑块形成，而高脂饮食组大鼠主动脉出现明显的混合斑块，脂质沉积明显，纤维帽变薄，斑块的稳定性进一步下降。

2.2 主动脉内EMMPRIN 和μPA 表达情况

经检测对比显示，喂养第6、10、14、18 周时高脂饮食组大鼠主动脉内EMMPRIN 和μPA 的表达明显高于对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05）（表1）。

表1 2 组大鼠不同时间主动脉内EMMPRIN 和μPA 蛋白及mRNA 表达水平对比（±s）Tab 1 Comparison of EMMPRIN and μPA protein and mRNA expression levels in the aorta between the two groups at different time points（±s）

表1 2 组大鼠不同时间主动脉内EMMPRIN 和μPA 蛋白及mRNA 表达水平对比（±s）Tab 1 Comparison of EMMPRIN and μPA protein and mRNA expression levels in the aorta between the two groups at different time points（±s）

*P＜0.05 vs control

Group Observation time point EMMPRIN μPA EMMPRIN mRNA μPA mRNA Control 6th week 0.061±0.012 0.403±0.012 0.106±0.011 0.026±0.003 10th week 0.236±0.015 0.613±0.012 0.173±0.023 0.156±0.021 14th week 0.269±0.014 0.698±0.021 0.216±0.051 0.268±0.015 18th week 0.276±0.013 0.763±0.151 0.256±0.020 0.369±0.011 High fat diet 6th week 0.421±0.032* 0.701±0.021* 0.336±0.051* 0.426±0.065*10th week 0.498±0.026* 0.769±0.023* 0.462±0.036* 0.536±0.012*14th week 0.733±0.021* 0.823±0.016* 0.513±0.041* 0.869±0.015*18th week 0.889±0.032* 1.035±0.032* 0.956±0.036* 1.326±0.015*

2.3 主动脉内EMMPRIN 和μPA mRNA 表达情况

经检测对比显示（表1），喂养第6、10、14、18 周时高脂饮食组大鼠主动脉内EMMPRIN 和μPA的mRNA 表达明显高于对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。分析两者表达水平相关性，显示EMMPRIN 与μPA 表达呈正相关关系（r=0.635，P＜0.05）（表1）。

3 讨论

据世界卫生组织调研指出，目前心血管疾病已成为死亡率最高的疾病之一，2004年全球约有1 710 万人死于心血管疾病，死亡率约占全部疾病的29%，其中死于冠心病人数达720 万人，死于卒中人数达570 万人。世界卫生组织预测，到2030年，全球会有近2 360 万人死于心血管相关疾病。近些年随着我国人民生活水平的提升和人口老龄化趋势的显现，各类心血管相关疾病的发病率及死亡率也有逐年递增趋势[13-15]。动脉粥样硬化是心血管疾病的主要病理基础，其病变受个体体质、后天环境等多种因素的影响[16]。动脉粥样硬化的本质是一类在大、中型动脉部位发生的，以大量脂质和胆固醇聚集生成纤维斑块为特征的慢性炎症性疾病。当前的临床研究指出，炎性反应、胆固醇代谢异常、巨噬细胞泡沫化、脂质代谢障碍等都与动脉粥样硬化的发生发展存在一定关联[17]，临床研究也多从上述方向出发，探究干预动脉粥样硬化进程的方式方法。

EMMPRIN 是一种分子量约为58 kD 的跨膜糖蛋白，属于免疫球蛋白超家族的一员，其主要功能为参与细胞与细胞间的识别、细胞-基质的黏附，同时还在诱导和调控基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP） 表达中也发挥重要作用。而MMP 在平滑肌、巨噬细胞中呈现高表达态，具有降解细胞外基质的作用。李凤等[18]通过研究指出，MMP 基因多态性与动脉粥样硬化性脑梗死具有密切联系，MMP 多态性是脑梗死复发的独立危险因素，MMP 的过度表达会增加细胞外基质降解，造成血脑屏障开放和血管通透性增加，诱发血管源性脑水肿。张锋等[19]的研究也指出，MMP-8 能够通过降解胶原蛋白及其他活性物质，调节内皮细胞、平滑肌细胞、中性粒细胞和干细胞的功能，加快动脉粥样硬化斑块的发生发展，增加斑块的不稳定性，同时MMP 还与冠心病的发生及预后具有密切联系。μPA 是纤溶酶原系统的重要组成部分，具有一定的促动脉粥样硬化作用。杨丽霞等[20]的研究则指出，μPA 会降低冠状动脉粥样硬化斑块的稳定性，加重冠心病患者病情。

本研究结果显示，相比于正常饮食的ApoE 敲除大鼠，实施高脂饮食的大鼠干预18 周后动脉粥样硬化斑块形成更为明显，斑块稳定性更差。进一步分析显示，相比于对照组大鼠，高脂饮食组大鼠的EMMPRIN 与μPA 蛋白呈现明显的高表达态，EMMPRIN 与μPA mRNA 表达也明显高于对照组大鼠。这与杨丽霞等[20]的研究结果相一致，该学者通过对冠心病患者实施对比分析表明，软斑块患者EMMPRIN 与μPA 蛋白水平明显要高于纤维斑块和钙化斑块患者。笔者分析认为，EMMPRIN是MMP 的上游调控因子，最早于肿瘤细胞表面被发现，该蛋白在内皮细胞、单核细胞中具有诱导MMP 产生的效果，而上文提到MMP 的过量表达不仅会对血管内皮产生损害，加快动脉粥样硬化斑块的形成，同时还会加速斑块纤维帽溶解，降低斑块的稳定性，本研究高脂饮食组大鼠喂养18 周时主动脉斑块纤维帽变薄就证实了该观点。也有较多的研究指出μPA 在动脉壁局部具有促使基质降解、细胞黏附和细胞迁移增殖及细胞因子调节等作用。田祥全等[21]报道，μPA 具有致动脉粥样硬化作用，能够通过激活纤溶酶原，使纤溶酶生成增多，影响血栓的形成，进而加快动脉粥样硬化进程。本研究结果也证实，μPA 的高表达与动脉粥样硬化进程具有密切的相关性，随着μPA 蛋白表达的升高，大鼠动脉粥样硬化斑块也呈现明显加重趋向。

总之，EMMPRIN 与μPA 在ApoE 敲除大鼠主动脉粥样硬化斑块中随着斑块病情的加重而表达量会出现升高，同时EMMPRIN 及μPA 表达呈正相关，表明两者可能参与动脉粥样硬化斑块的形成且发挥促进作用。