CCL5/CCR5基因启动子多态性与糖尿病性微血管并发症的相关性评估

李华君，董艳芳，孔五宝，罗 英，金倩倩，王晓蕴，王元松，孙云川，牛跃龙，赵红敏

近年来，糖尿病的患病率迅速增加[1-3]。糖尿病性微血管并发症(DMI)，例如糖尿病肾病(DN)和糖尿病视网膜病变(DR)，是最具破坏性的糖尿病临床表现[4-6]。DMI的危险因素包括高血糖、高血压和遗传因素。尽管降血糖和降高血压治疗是一种有效的方法，但许多患者最终还是会发生DMI，甚至是在血糖和血压达到正常水平的情况下[7-8]。所以，上述患者可能存在与DMI相关的遗传危险因素。此外，DMI被认为是与细胞因子相关的先天性免疫反应，而特定细胞因子的下调可以降低DMI的发生率。识别具有较高风险的细胞因子将有助于DMI的早期预防护理。趋化因子配体5(CCL5)是C-C趋化因子家族的成员，主要在CD8+ T细胞表达[9-10]。CCL5具有募集、激活和刺激T细胞的能力，从而介导先天性和适应性免疫反应[11]。CCL5的同源受体，趋化因子受体5(CCR5)是G偶联7次跨膜趋化因子受体，是β型趋化因子受体家族的成员，主要表达于T细胞和巨噬细胞[12-13]。CCR5的遗传失活与单核细胞/巨噬细胞进入受损血管的减少有关，这是DMI发病机理中最早的事件。此外，相关研究已经表明，CCL5/CCR5表达在DN或DR患者中增加，并且其异常表达与肾损伤或眼内新生血管形成有关[14-15]。因此，CCL5或CCR5基因的突变可能是DMI的致病因素。筛选CCL5/CCR5基因的序列变异可以鉴定出几种遗传变异体。最常见的多态性是CCL5-403 G/A(G到A改变)，CCL5-28 C/G(C到G改变)和CCR5-59029 G/A(G到A改变)。但是，有关CCL5-403 G/A、CCL5-28 C/G、CCR5-59029 G/A和DMI风险的研究存在争议[16]。一些研究表明，CCL5和CCR5基因变异可能是DMI的易感因素[17]。然而，该结果没有被其他研究证实。本研究的主要目的是对CCL5/CCR5基因变异与DMI风险之间的关联进行更精确的评估。次要结果是确定可能影响CCL5/CCR5基因多态性与DMI风险之间关联强度的因素。

1 资料及方法

1.1研究资料 搜索PubMed、Embase、Medline、中国国家知识基础设施、Web of Science、Cochrane数据库以及相关研究的参考文献清单。将术语“CCR5”“CCL5”和“RANTES”与“糖尿病”或“DMI”或“DN”或“糖尿病肾病”或“DR”或“糖尿病视网膜病变”或“变异”或“突变”或“多态性”进行检索。对语言或文章是否已发表没有限制。本研究还检查了这些文章的参考文献，以筛选出其他相关出版物。此外，根据“首选评价和荟萃分析报告”声明进行了荟萃分析。

1.2研究选择标准 纳入文章符合以下标准：①病例对照研究：以DN和(或)DR患者为病例组，无并发症糖尿病患者为对照组；②前瞻性队列研究；③与CCL5-403 G/A，CCL5-28 C/G和CCR5-59029G/A多态性和DMI风险相关的研究。排除标准：①非病例对照研究；②对照组包括非糖尿病患者；③糖尿病患者合并严重的其他疾病，例如恶性肿瘤和严重的心脏功能障碍。

1.3数据提取 审查研究资格，并提取DMI中遗传变异的频率差异。当包含同一作者的一项以上研究时，本研究仅包括最完整的研究。从文章中提取的数据包括作者姓名、文章年份、种族、基因型病例和对照受试者的数量、年龄、性别、糖化血红蛋白水平和糖尿病亚型。

1.4统计学方法 Hardy-Weinberg平衡由χ2检测。通过优势比(OR)和95%置信区间(CI)评估遗传变异和DMI关联的强度。如果关联显示异质性(I2>25%)，则将随机效应模型合并。此外，进行敏感性分析以确定异质性的来源，从而评估异质性是否显著影响结果。通过以下方法分析CCL5/CCR5基因突变与DMI之间的关联：CCL5-403 G/A(GA+AA vs GG；AA vs GA+GG)，CCL5-28 C/G(GC+CC vs GG；CC vs GC+GG)和CCR5-59029G/A(GA+AA vs GG；AA vs GA+GG)。在这些病例对照组中计算A等位基因(CCL5-403 G/A和CCR5-59029 G/A)和G等位基因(CCL5-28 C/G)的风险频率。糖尿病的亚型(1型糖尿病或2型糖尿病)，DMI的特定类型(DN或DR)，DN的阶段[微量白蛋白尿、大量蛋白尿或终末期肾脏疾病(ESRD)]和种族(高加索人或亚洲人)进行分层分析。Egger的测试和Rosenthal的故障安全编号(Nfs)用于测试发布偏差。P<0.05的值被认为是显著差异。对于每个元比较，Nfs的显著性均设置为0.05。如果计算出的Nfs值小于研究次数，则荟萃分析结果可能显示存在发表偏倚的风险。公式Nfs0.05=(ΣŽ/1.64)2-(是包括在本研究的物品数量)。所有分析均使用Review Manager 5.2(Cochrane Collaboration，英国牛津)和STATA 10.0(美国德克萨斯州大学城，StataCorp)统计软件程序。这项荟萃分析是使用Mantel-Haenszel统计方法和样本量进行比较的加权均数差。

2 结果

2.1研究特征 本研究选取了601篇相关研究的报告，然后对文章进行检查及筛选。总共招募了2737例DMI患者和2435例糖尿病对照。在这些研究中，9项评估为白蛋白尿，其中3项评估为微量白蛋白尿，5项评估为大量白蛋白尿和1项评估为ESRD。

2.2主要荟萃分析结果

2.2.1CCL5-403G/A、CCL5-28 C/G和DMI的危险因素分析：之所以使用固定效应模型，是因为数据的异质性<30%。结果表明CCL5-403 G/A、CCL5-28 C/G多态性与DMI无显著相关性(CCL5-403 G/A的OR为1.00；95%CI为0.82，1.21；P=0.98。CCL5-28 C/G的OR为1.02；95%CI为0.79，1.33；P=0.87)。对糖尿病和种族的亚型进行亚组分析发现，单独排除两个变量不会对合并的关联产生显著变化。见表1。

表1 优势模型对CCL5多态性和DMI风险的Meta分析

2.2.2CCR5-59029 G/A和DMI的危险因素分析：当将CCR5-59029 GA+AA基因型设置为主要危险因素时，结果表明CCR5-59029 GA+AA基因型与DMI风险增加相关(OR为1.77；95%CI为1.06，2.97；P=0.02)。当将AA基因型设为隐性危险因素时，AA基因型与DMI风险之间没有显著相关性(OR为1.28；95%CI为0.75，2.17；P=0.36)。这些结果表明，CCR5 59029A阳性基因型(G/A或A/A)是DMI的独立危险因素。为了进一步评估DMI(I2=85%)的异质性原因，选择种族、DMI的特定类型和DN阶段进行亚组分析。结果表明，种族和DN阶段与异质性相关。在排除高加索人之后，异质性消失(I2=0%)，并且在亚洲人中发现了显著的关联(OR为2.08；95%CI为1.68，2.57，P<0.001)。CCR5 59029A阳性基因型显著增加白蛋白尿的风险(微量白蛋白尿OR为1.68；95%CI为1.15，2.44；P=0.01；大量蛋白尿OR为2.70；95%CI为1.07，6.83；P=0.04)。由于只有1项针对ESRD的试验，本研究无法探讨CCR5 59029A阳性基因型与ESRD风险之间的关系。见表2。

表2 优势模型对CCR5多态性和DMI风险的Meta分析

2.3出版偏倚 测试了纳入研究的所有结果的偏倚。漏斗图显示，在这些研究中未发现明显的出版偏倚。见图1～3。本研究还计算了CCL5-403 G/A、CCL5-28 C/G和CCR5-59029 G/A的Nfs0.05。每个比较的Nfs0.05值均大于本研究中包括的研究数量。

图1 CCL5-403 G/A多态性与DMI风险关联的发表偏倚漏斗图

图2 CCL5-28 C/G多态性与DMI风险关联的发表偏倚漏斗图

图3 CCR5-59029 G/A多态性与DMI风险关联的发表偏倚漏斗图

3 讨论

单核苷酸多态性的遗传流行病学研究可以探索候选基因与疾病风险之间的关联[18-19]。在目前的荟萃分析中发现CCL5基因多态性与DMI的风险没有正相关。但是，CCR5中的59029A多态性可能会影响个体对DMI的易感性，而CCR5 59029A阳性基因型与亚组(分别为“2型糖尿病”或“亚洲人”)中DMI风险增加相关。此外，CCR5 59029A阳性基因型与微量白蛋白尿和大量蛋白尿的风险增加相关。

种族差异可能部分归因于遗传和地理环境之间的相互作用。考虑到DMI具有复杂的病因，涉及环境和遗传因素的综合影响，因此不同种族的人群具有不同的等位基因频率和遗传背景，这可能会影响DMI的风险。在本研究中发现，高加索人群中“A”等位基因的发生频率(病例组：平均0.0035，范围0.002～0.006；对照组：平均0.0057，范围0.002～0.015)低于亚洲人群(病例组：平均0.0123，范围0.004～0.029；对照组：平均0.0080，范围0.002～0.011)，这可能是不同种族之间遗传易感性变化的来源之一。此外，种族可能与治疗活动相关，例如药物使用或血糖目标。Mokubo等[20]发现，亚洲患者中CCR5 59029A阳性基因型和10年平均糖化血红蛋白值与DMI风险呈正相关。但是，Mlynarski等[21]未能找到与高加索人的这种关联。因此，治疗活动可能是研究不一致的原因。

CCL5基因多态性与DMI的风险没有显著相关性。此外，本研究只集中在DMI，并没有评估CCL5基因多态性与其他疾病，如动脉粥样硬化、多发性硬化症和变应性哮喘的相关性。CCL5基因多态性的潜在作用可能被其他基因-基因或基因-环境相互作用所掩盖。

DMI是由多种遗传和环境危险因素共同作用引起的。在本研究中发现，在亚洲人中，CCR5 59029A阳性基因型是DMI的重要易感因素，这表明CCR5中的rs1799987基因变异可能会增加亚洲人DMI的风险。因此，在亚洲人群中，CCR5可能为DMI的早期预防性检测提出了新的目标。

此外，对本研究中纳入研究的所有结果进行了出版偏倚测试。通过漏斗图显示，在发表的这些研究中未发现明显的出版偏倚。且本研究还计算了CCL5-403 G/A、CCL5-28 C/G和CCR5-59029 G/A的Nfs0.05。每个比较的Nfs0.05值均大于本研究中包括的研究数量。

本研究具有一些局限性。首先，CCL5多态性的样本量相对较小，需要进一步的研究以确认结论。其次，本研究仅关注CCL5/CCR5启动子上的单核苷酸多态性，还应研究CCL5/CCR5基因中的其他单核苷酸多态性以阐明CCL5/CCR5在DMI中的作用。再次，在这项荟萃分析中，大多数高加索人研究涉及1型糖尿病，但不涉及2型糖尿病。CCR5基因多态性与高加索人DMI风险之间缺乏关联可能部分归因于糖尿病的类型而非种族。

综上所述，CCL5基因启动子多态性与DMI的风险没有关联。但是，CCR5 59029A多态性会影响个体对DMI的敏感性。