miR-181及miR-146家族在不同甲状腺癌细胞株中的表达及与BRAFV600E基因突变的关系

田延锋，李 芳，张 杰，胡毅平，刘 擘，姜 霞，李冬蕴

甲状腺癌是内分泌系统最常见的恶性肿瘤。大量研究表明，miRNA能扮演癌基因或抑癌基因的角色，其表达失调在肿瘤的发生与转移过程中发挥着重要作用[1]，其在甲状腺癌中的研究也受到关注。既往研究表明，miR-146b及miR-181均与甲状腺癌患者的BRAF基因突变有关[2]，但miR-146b及miR-181家族其他成员的相关研究鲜有报道。本研究采用实时定量PCR(qRT-PCR)法，以U6为内参，通过检测不同甲状腺癌细胞中miR-146及miR-181家族各成员的表达及与BRAFV600E突变的相关性，初步探讨miR-146及miR-181家族各成员在甲状腺癌发生、发展过程中的作用及对甲状腺癌早期诊断及预后判断的意义。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞与培养：甲状腺癌细胞株BCPAP细胞(BRAFV600E基因突变)购于广州吉妮欧生物科技有限公司，甲状腺癌细胞株TPC-1细胞(无BRAFV600E基因突变)购于上海锐赛生物技术有限公司。2种细胞的培养条件：DMEM培养基(Gibco公司)，10%胎牛血清(Gibco公司)，1% P/S，1% GLn，37℃，5% CO2，饱和湿度条件下培养，贴壁生长及传代培养以用于实验。

1.1.2试剂与设备：提取miRNA的Trizol试剂购自美国Invitrogen公司；反转录及qRT-PCR试剂盒，所用内参U6、miR-146a、miR-146b、miR-181a、miR-181b、miR-181c和miR-181d的引物均购自广州复能基因有限公司。U6引物序列：5'-ACGCAAATTCGTGAAGCGTT-3'；miR-146a引物序列：5'-UGAGAACUGAAUUCCAUGGUU-3'；miR-146b引物序列：5'-UGAGAACUGAAUUCCAUAGGCUG-3'；miR-181a引物序列：5'-AACAUUCAACGCUGUCGGUGAGU-3'；miR-181b引物序列：5'-AACAUUCAUUGCUGUCGGUGGGU-3'；miR-181c引物序列：5'-AACAUUCAACCUGUCGGUGAGU-3'；miR-181d引物序列：5'-AACAUUCAUUGUUGUCGGUGGGU-3'。7500荧光定量PCR仪购自美国ABI公司。

1.2方法

1.2.1RNA提取：根据Trizol使用说明书提取组织总RNA后，分光光度计检测RNA的浓度及A260/A280的数值，结果A260/A280>1.8。

1.2.2miR-146和miR-181表达检测：采用qRT-PCR法检测细胞中miR-146a、miR-146b、miR-181a、miR-181b、miR-181c和miR-181d的表达。细胞培养48 h后收样，弃培养基加入Trizol裂解液1 ml，按Trizol法提取总RNA，测量总RNA浓度。取总RNA 1 μl，2.5 U/μl Poly A Polymerase 1 μl，5×PAP/RT Buffer 5 μl，RTase Mix 1 μl，加ddH2O(RNase/DNase free)至25 μl配制成逆转录体系，按照All-in-oneTM miRNA First-Stand cDNA Synthesis Kit试剂盒操作说明进行逆转录。反应温度：37℃，60 min，85℃，5 min，4℃保存备用。按照All-in-oneTM miRNA qPCR Primers试剂盒操作说明检测miR-181及miR-146家族各成员在细胞中的表达量，以U6作内参，以2-ΔΔCt值计算各组细胞中miR-181及miR-146家族各成员的相对表达量。根据待测标本的Ct值，以U6作为内参照，采用定量PCR中的相对定量法，以n=2-ΔCt表示标本中miR-146a、miR-146b、miR-181a、miR-181b、miR-181c及miR-181d的相对表达量，其中ΔCt=CtmiR-146/181-CtU6。

2 结果

2.1TPC-1和BCPAP细胞中miR-181和miR-146家族各成员的相对表达量 miR-146a、miR-146b、miR-181a、miR-181b、miR-181c和miR-181d在TPC-1和BCPAP细胞中的相对表达量见表1。

表1 TPC-1及BCPAP细胞中miR-146a、miR-146b、miR-181a、miR-181b、miR-181c和miR-181d的表达情况

2.2miR-181和miR-146家族各成员的表达与BRAFV600E基因突变的关系 miR-146a、miR-181a、miR-181b、miR-181c及miR-181d在BRAFV600E基因突变细胞株BCPAP中的表达量较无BRAFV600E基因突变细胞株TPC-1明显增高(P<0.01)。而miR-146b在BRAFV600E基因突变细胞株BCPAP中的表达量较无BRAFV600E基因突变细胞株TPC-1明显减低(P<0.01)。见表2和图1。

图1 miR-146a、miR-146b、miR-181a、miR-181b、miR-181c及miR-181d在TPC-1及BCPAP细胞中的表达量比较

表2 TPC-1与BCPAP细胞中miR-146a、miR-146b、miR-181a、miR-181b、miR-181c和miR-181d表达水平比较

3 讨论

近年来，甲状腺癌的发病率逐年升高，已引起人们的广泛关注。随着分子生物学的发展，人们认识到仅根据以往的临床病理指标已不足以对甲状腺癌的早期诊断和预后做出准确的判断，而需要从基因水平寻找进一步判断的方法。BRAFV600E基因突变及miRNAs的表达失调在甲状腺癌的发生与转移过程中发挥着重要作用，已成为肿瘤研究的热点。

多种miRNA在甲状腺癌中的表达水平有不同程度的上调或下调，如miR-146、miR-155、miR-181、miR-187、miR-221、miR-222、miR-224、miR-197、miR-30、miR-152等[3-5]。其中miR-146及miR-181上调均可通过调节核因子-κB通路而促进细胞炎症反应，从而促进正常细胞向肿瘤细胞转化[6-7]；同时BRAFV600E基因突变同样可以通过核因子-κB的活化增加金属蛋白酶组织抑制剂-1及基质金属蛋白酶-3的表达，从而增加甲状腺癌的侵袭性[8]。而miRNAs的表达与BRAFV600E基因突变有无相关性尚有争论。

既往的实验研究表明，miR-181家族各成员在大部分的肿瘤中起到致癌作用，但在非小细胞肺癌和胶质瘤中发挥抑癌作用[9-11]。其中miR-181a作为上皮间质转化调节因子的作用在肺腺癌细胞系中被证实[12]。miR-181b以转化生长因子-β1依赖性方式调节肺腺癌[13]。对于患有肾乳头状细胞癌的患者，miR-181c的下调表达与更差的总生存期相关[4]。在胶质瘤及B细胞淋巴瘤中miR-181d的靶基因强调其肿瘤抑制作用[14]。其中miR-181b在某些肿瘤如结肠癌、乳腺癌、肺癌中高表达[15-17]。本实验结果显示，miR-181b和miR-181d均在甲状腺癌中呈高表达，但各自在甲状腺癌中的作用尚不明确。Qiu等[18]的研究显示，miR-146a和miR-146b在甲状腺乳头状癌组织中表达明显上调。本实验证实，miR-146a在甲状腺癌中高表达，但根据以往诸多实验推测，虽然miR-146b较miR-146a表达低，但miR-146b在甲状腺癌中可能同样呈高表达状态。而关于miR-146对甲状腺癌生物学行为的影响需还进一步的实验证实。

BRAF基因V600E的点突变是丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)途径异常的主要原因，而MAPK途径的异常激活是甲状腺癌的主要遗传学改变。该信号通路具有调节细胞生长、增殖和凋亡的重要作用。本研究发现miR-146a及miR-181家族中各成员的表达在BRAFV600E基因突变细胞株BCPAP中较无BRAFV600E基因突变细胞株TPC-1明显升高，miR-146b的表达明显减低。该结果表明miR-146及miR-181家族中各成员的表达与BRAFV600E基因突变有极强的关联。Chou等[19]的研究同样显示，在BRAFV600E基因突变的甲状腺乳头状癌患者中miR-146b表达显著低于对照的BRAFV600E基因未突变组，与本实验结果一致。

虽然关于甲状腺癌中miRNA相关研究仍处于初级阶段，而且miRNA的表达失调在甲状腺癌中发挥的作用及机制也有待进一步研究。但是，可以肯定miRNAs在甲状腺癌的发生、发展过程中具有重要作用，并且miRNAs在外周血中表达较为稳定，不易被内源性RNA酶降解。故本研究为下一步通过体外调控miR-146a、miR-181b、miR-181d的表达对甲状腺乳头状癌细胞系生物学行为的影响奠定了基础。BRAFV600E基因突变和miR-146及miR-181家族成员有望成为甲状腺恶性肿瘤筛查、诊断、预后评估新的分子标记物。