亚硒酸钠对皮瓣缺血再灌注损伤的保护作用

荀伟 魏海涛 刘瑞 王敏

【摘要】 目的 观察亚硒酸钠对大鼠腹壁浅血管皮瓣缺血再灌注损伤的保护作用及机制。方法 利用雌性Wistar大鼠制作腹壁浅血管为蒂的缺血再灌注皮瓣模型并进行实验， 将30只大鼠按照随机数字表法分为假手术组、缺血再灌注+亚硒酸钠组、缺血再灌注+生理盐水组， 每组10只。假手术组不做缺血再灌注处理， 缺血再灌注+亚硒酸钠组术前3 d腹腔注射亚硒酸钠0.5 mg/kg（每24小时1次）， 缺血再灌注+生理盐水组术前3 d腹腔注射等体积生理盐水（每24小时1次）。缺血再灌注+亚硒酸钠组与缺血再灌注+生理盐水组于皮瓣缺血1 h再灌注1 h之后， 假手术组于术后2 h， 取皮瓣中间靠外侧组织检测丙二醛含量， 光鏡下观察病理组织变化。术后7 d大体观察皮瓣存活情况。结果 缺血再灌注+生理盐水组大鼠皮瓣再灌注后丙二醛含量为（17.89±2.85）nmol/g， 与假手术组的（10.38±3.45）nmol/g比较， 差异有统计学意义（P<0.05）;缺血再灌注+亚硒酸钠组大鼠皮瓣缺血再灌注后丙二醛含量为（11.06±1.47）nmol/g， 与缺血再灌注+生理盐水组的（17.89±2.85）nmol/g比较， 差异有统计学意义（P<0.05）。病理组织变化：假手术组脂肪组织内充满脂肪滴， 胞质位于细胞边缘成一薄层， 核亦被挤到细胞的边缘， 细胞结构完整， 饱满;缺血再灌注+生理盐水组可见脂肪细胞结构破坏， 杂乱无章。术后7 d皮瓣大体存活情况：亚硒酸钠组皮瓣成活面积较生理盐水组皮瓣成活面积大。手术7 d后皮瓣情况及成活面积：缺血再灌注+生理盐水组皮瓣大部分出现颜色变黑， 干燥收缩， 质地变硬， 弹性及回缩性变差， 脆性增加， 刀切后无出血等坏死的表现。缺血再灌注+亚硒酸钠组皮瓣只是在边缘区域出现部分坏死组织， 成活面积大于生理盐水组。假手术组皮瓣仅仅是缝线处有微小组织坏死， 造成缝线脱落， 皮瓣几乎完全成活。结论 亚硒酸钠具有拮抗氧自由基， 减轻自由基的脂质过氧化作用， 对缓解皮瓣的缺血再灌注损伤起着一定的作用。

【关键词】 亚硒酸钠;皮瓣;缺血再灌注损伤

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2020.27.091

亚硒酸钠在20世纪30年代首次在临床用于治疗克山病。随着克山病被基本控制， 亚硒酸钠也渐渐淡出了临床。近30年来， 随着科学界对金属元素硒的研究逐渐深入， 亚硒酸钠又重新引起临床的关注。多年来的研究已经证实亚硒酸钠具有多种生物学作用， 如免疫调节、抑制肿瘤细胞生长、减少射线所致的损伤， 抗病毒、抗衰老、抗氧自由基等[1-3]。亚硒酸钠在缺血再灌注损伤中抗氧自由基保护组织器官的作用目前研究很广。研究者们已经以心脏、神经系统、肾脏及肠等组织器官为媒介， 探讨了亚硒酸钠在缺血再灌注损伤中的保护作用。但是目前将亚硒酸钠应用于皮瓣的缺血再灌注损伤还未见相关报道。本实验则是利用皮瓣作为相关载体， 将亚硒酸钠应用其中， 进一步探讨缺血再灌注损伤中亚硒酸钠是否具有保护作用， 从而为临床外科皮瓣围手术期用药提供新的手段和理论依据。

1 材料与方法

1. 1 实验动物 健康成年雌性Wistar大鼠30只， 体重（220±10）g， 内蒙古大学实验动物中心提供。

1. 2 主要药品与试剂 亚硒酸钠片（上海天赐福生物工程有限公司）0.2 mg×30片， 考马斯亮蓝蛋白含量测试盒及丙二醛测试盒（南京建成生物工程研究所）。

1. 3 主要设备 离心机 （XIANG YI H1650-W）， 电热恒温水浴箱（CIMD 新苗 H.SMX-420BS）， 分光光度计， 电子天平 （SARLTORIUS BS110 S MAX 110 g d=0.1 mg）。

1. 4 实验方法

1. 4. 1 动物分组 30只大鼠， 按照随机数字表法分为假手术组、缺血再灌注+亚硒酸钠组、缺血再灌注+生理盐水组， 每组10只。假手术组不做缺血再灌注处理， 缺血再灌注+亚硒酸钠组术前3 d腹腔注射亚硒酸钠0.5 mg/kg（每24小时1次）， 缺血再灌注+生理盐水组术前3 d腹腔注射等体积生理盐水（每24小时1次）。

1. 4. 2 动物模型制作 用腹腔注射的方法注入10%水合氯醛0.4 ml/100 g麻醉Wistar大白鼠。诱导成功后， 仰卧位绑定于鼠台上， 充分暴露腹部。右下腹部剪毛， 硫化钠脱毛（范围应大于拟定皮瓣尺寸）。用标记笔在右下腹皮肤上标记3.0 cm×5.0 cm划线用Petry-Wortham法进行皮瓣手术操作。常规碘伏消毒， 带无菌手套， 铺无菌孔巾， 将手术范围充分暴露后实施手术。沿标记线剪开皮肤直达皮下筋膜层， 分离筋膜层与腹肌后仔细寻找腹壁浅动静脉及股动静脉并充分暴露各血管。之后将皮瓣完全游离并观察皮瓣的血液循环情况。仔细分离并暴露腹壁浅动静脉， 在股血管分出腹壁浅血管处用显微止血夹（窄形5）夹闭制造缺血状态。此时开始计时， 1 h后将止血夹移除制造再灌注状态， 再灌注1 h后取皮瓣中段边缘全层皮瓣组织

1.0 cm×1.0 cm用于丙二醛含量测定及病理组织切片观察。最后将皮瓣缝合于原位置上， 碘伏消毒， 纱布简单包扎后分笼饲养。

1. 4. 3 丙二醛含量测定 将取下皮瓣制备成0.5 cm×

1.0 cm大小组织2份， 一份用于丙二醛含量测定， 另一份用于病理组织切片观察。将组织块上的动物毛发尽量清除干净， 冰生理盐水清洗， 吸水纸擦干， 微量天平称重， 加9倍重生理盐水， 匀浆器匀浆， 3000 r/min离心机离心10 min后取上清液， 按照说明书操作， 先测组织蛋白含量， 记录所得数据。后测组织中丙二醛含量（需要蛋白含量值代入公式）。

1. 4. 4 病理切片 取另一份0.5 cm×1.0 cm组织放入10%甲醛固定液中固定24 h， 后逐步进行脱水透明， 侵蜡包埋， 切片贴片， 染色封片等步骤， 成功后显微镜下观察组织学变化。

1. 4. 5 大体观察 术后7 d观察皮瓣颜色， 回缩弹性， 质地， 切割后有无出血及皮瓣成活面积。

1. 3 统计学方法 采用SPSS22.0统计学软件进行数据统计分析。计量资料以均数±标准差 （ x-±s）表示， 采用t检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2. 1 三组手术后2 h皮瓣组织丙二醛含量比较 缺血再灌注+生理盐水组大鼠皮瓣再灌注后丙二醛含量为（17.89±2.85）nmol/g， 与假手术组的（10.38±3.45）nmol/g

比较， 差异有统计学意义（t=5.307， P<0.05）;缺血再灌注+亚硒酸鈉组大鼠皮瓣缺血再灌注后丙二醛含量为（11.06±1.47）nmol/g， 与缺血再灌注+生理盐水组的（17.89±

2.85）nmol/g比较， 差异有统计学意义（t=6.735， P<0.05）。

2. 2 三组大鼠皮瓣病理形态结构 由于手术后2 h即取材做病理组织学切片观察， 所以皮瓣组织大部分细胞还没有出现明显变化， 只有脂肪组织发生了变化。假手术组脂肪组织内充满脂肪滴， 胞质位于细胞边缘成一薄层， 核亦被挤到细胞的边缘， 细胞结构完整， 饱满。缺血再灌注+生理盐水组可见脂肪细胞结构破坏， 杂乱无章。缺血再灌注+亚硒酸钠组脂肪结构趋于稳定， 无显著变化。

2. 3 三组皮瓣术后7 d大体观察 缺血再灌注+生理盐水组皮瓣大部分出现颜色变黑， 干燥收缩， 质地变硬， 弹性及回缩性变差， 脆性增加， 刀切后无出血等坏死的表现。缺血再灌注+亚硒酸钠组皮瓣只是在边缘区域出现部分坏死组织， 成活面积大于生理盐水组。假手术组皮瓣仅仅是缝线处有微小组织坏死， 造成缝线脱落， 皮瓣几乎完全成活。

3 讨论

缺血组织再灌注时造成的微血管和实质器官的损伤主要是由活性氧自由基引起的， 这已在多种器官中得到证明。在缺血组织中具有清除自由基的抗氧化酶类合成能力发生障碍， 从而加剧了自由基对缺血后再灌注组织的损伤[4-6]。谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）是机体内广泛存在的一种重要的过氧化物分解酶。硒是GSH-Px酶系的组成成分， 其能催化GSH变为氧化型谷胱甘肽（GSSG）， 使有毒的过氧化物还原成无毒的羟基化合物， 同时促进H2O2的分解， 从而保护细胞膜的结构及功能不受过氧化物的干扰及损害。GSH-Px的活性中心是硒半胱氨酸， 其活力大小可以反映机体硒水平。人体适当的补充金属元素硒有助于提高抗氧化能力， 而且硒的制剂形式与其抗氧化能力有很大的关联， 实验证实亚硒酸钠在各种硒化合物中药理作用最强[7， 8]。本实验在皮瓣手术前3 d开始给予大鼠预防剂量的亚硒酸钠就是要提高其抗氧化能力就是基于这个理论根据。氧自由基能够攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸（PUFA）引发脂质过氧化反应， 并因此形成了脂质过氧化物， 如丙二醛。本实验检测丙二醛含量目的是其能够间接反应机体此时的抗氧化能力的高低。本实验取材测定皮瓣组织丙二醛含量为： 缺血再灌注+生理盐水组大鼠皮瓣再灌注后丙二醛含量为

（17.89±2.85）nmol/g， 与假手术组的（10.38±3.45）nmol/g

比较， 差异有统计学意义（P<0.05）;缺血再灌注+亚硒酸钠组大鼠皮瓣缺血再灌注后丙二醛含量为（11.06±

1.47）nmol/g， 与缺血再灌注+生理盐水组的（17.89±

2.85）nmol/g比较， 差异有统计学意义（P<0.05）。实验结果表明， 亚硒酸钠能够增加抗氧化酶的作用， 抑制氧自由基的蓄积， 从而降低生物膜的损伤， 降低脂质过氧化反应， 从而使丙二醛的含量降低。

本实验再灌注后取材病理切片观察， 仅仅于术后2 h就出现了一定的组织结构变化。首先体现在脂肪细胞上面， 假手术组脂肪组织内充满脂肪滴， 胞质位于细胞边缘成一薄层， 核亦被挤到细胞的边缘， 细胞结构完整， 饱满。缺血再灌注+生理盐水组可见脂肪细胞结构破坏， 杂乱无章。缺血再灌注+亚硒酸钠组改变介于两者之间。本实验的结果充分说明亚硒酸钠具有减少氧自由基， 促进皮瓣成活的作用。术后7 d大体观察各实验组皮瓣成活面积， 虽然没有做统计学分析， 但还是能从一定角度说明亚硒酸钠可以提高皮瓣的成功几率。

综上所述， 亚硒酸钠能够有效抑制氧自由基的产生， 同时减少脂质过氧化反应， 降低丙二醛水平， 提高皮瓣存活率。

参考文献

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[2] Hwang K， Milner JA. Intracellular distribution of selenium and thegrowth of mammary cells in culture .Biol Trace Elem Res， 1996， 51（2）：133-147.

[3] 刘学东， 龚书明， 杨瑞华， 等. 亚硒酸钠对微波致视网膜神经节细胞损伤的防护作用.中华眼底病杂志， 2000， 16（2）：97-99.

[4] 刘琼， 王红， 胡德聪， 等.亚硒酸钠对肝细胞L-02端粒酶活性和端粒长度的作用. 生物化学与生物物理学报， 2003， 35（12）：1117-1122.

[5] 王智， 郅克谦， 许志鹏， 等.阿魏酸钠对大鼠游离皮瓣缺血再灌注损伤的保护作用.山东医药， 2014， 54（5）：21-22， 25.

[6] 陈刚， 邱宇， 腾跃辉， 等.阿魏酸钠对移植皮瓣缺血再灌注损伤保护的实验研究.中国美容医学， 2013， 22（17）：1774-1778.

[7] 陈英标， 戴帆， 卢强， 等.阿魏酸钠对皮瓣缺血再灌注损伤保护作用机制的研究进展.中国美容医学， 2012， 21（4）：682-685.

[8] 陈显兵.亚硒酸钠对全脑缺血再灌注脊髓损伤的保护作用.湖北民族学院学报（医学版）， 2006（1）：20-22.

[收稿日期：2020-05-11]