高效液相色谱法测定甘氨酰-D-谷氨酰胺的方法学建立与验证

杨万运，肖海荣，孙国琳，潘潇

（山东威高药业股份有限公司，山东威海 264200）

高效液相色谱法（high-performance liquid chromatography，HPLC）为常用分离和检测手段，在化学、医学、工业、农学、商检和法检等学科领域中均有广泛应用[1]，具有速度快、效率高、灵敏度高、自动化和适用性广等特点[2]，有着广泛的应用前景。

构成蛋白质的氨基酸都是L型氨基酸，甘氨酰-L-谷氨酰胺常被用于提供谷氨酰胺以促进蛋白质的合成。而经由化学合成得到的药物往往是对映体，不是单一的光学异构体。对于甘氨酰谷氨酰胺的一对对映体，甘氨酰-L-谷氨酰胺具有药理活性，而甘氨酰-D-谷氨酰胺则没有显著的药理作用。为了保证合成产物的光学纯度，严格控制合成过程中甘氨酰-D-谷氨酰胺的产生是一个十分重要的工作。

研制具有不对称中心药物时，需要用到多种手性色谱柱和手性流动相来进行测试，其测试时间长，效果不理想。甘氨酰谷氨酰胺为末端吸收，紫外吸收不强，采用手性色谱柱进行分离测定甘氨酰-D-谷氨酰胺不但成本高，而且分离难度大。目前有专利[3]采用衍生化原理对甘氨酰-D-谷氨酰胺进行分离检测的报道，但是其方法需要的反应时间长，还需要溶剂干燥、复溶、过滤等步骤，操作步骤烦琐。

因此，研发一种快速、简单、经济、应用范围广的甘氨酰-D-谷氨酰胺的高效液相检测方法是本领域技术人员亟需解决的技术问题。本文提供了一种简便、高效地检测甘氨酰-D-谷氨酰胺的高效液相方法，并对其可行性进行分析。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Waters e2695高效液相色谱仪，美国沃特世公司。甲酸，色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司；二乙胺，色谱纯，国药集团化学试剂有限公司；甲醇，色谱纯，上海安谱实验科技股份有限公司；甘氨酰-D-谷氨酰胺对照品、甘氨酰谷氨酰胺，威高药业股份有限公司；Waters AccQ·Fluor试剂盒，包括 Waters AccQ·Fluor硼酸缓冲液（Buffer1），Waters AccQ·Fluor衍生剂粉末（2A） 和Waters AccQ·Fluor衍生剂稀释剂（2B），美国Waters公司；超纯水，实验室自制。

1.2 色谱条件

用硅胶表面共价键合-奎宁（8R,9S）-（1R,2R）-环己基氨基磺酸衍生物为填充剂（0.40 cm×15 cm，3 μm）；以甲酸-二乙胺-甲醇（1.9∶2.6∶995.5）为流动相，柱温为20 ℃，检测波长为248 nm。

1.3 试验方法

1.3.1 溶液配制

（1）衍生试剂的制备

由2B瓶中吸取稀释剂1 mL至2A瓶中，加盖密封，震荡10 s，于55 ℃加热30 min，使衍生剂粉末全部溶解，取出放冷后，于干燥器内存放。

（2）供试品溶液的制备

取甘氨酰-L-谷氨酰胺适量，精密称定，加超纯水溶解制成浓度3 mg/mL的溶液，摇匀，即得。

（3）甘氨酰-D-谷氨酰胺对照品贮备溶液

取甘氨酰-D-谷氨酰胺对照品22.5 mg，精密称定，置50 mL量瓶中，加超纯水溶解并稀释至刻度，摇匀；量取5 mL，置50 mL量瓶中，加超纯水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

（4）甘氨酰-D-谷氨酰胺对照品溶液

精密量取甘氨酰-D-谷氨酰胺对照品贮备液2 mL，置20 mL量瓶中，加超纯水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

（5）测试溶液的制备

取甘氨酰谷氨酰胺约60 mg，精密称定，置20 mL量瓶中，精密加入甘氨酰-D-谷氨酰胺对照品贮备液2 mL，加超纯水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

（6）溶液衍生制备

精密量取待测溶液10 μL，置干燥的衍生管（直径6 mm，高50 mm）中，加入缓冲液（Buffer1）30 μL，涡旋混和，加入衍生试剂60 μL，涡旋混和15 s，样品管用石蜡膜封口，于55 ℃加热10 min，取出放冷至室温，转移至微量进样管中，即得。

1.3.2 测定方法

精密量取供试品溶液10 μL，置干燥的衍生管（直径6 mm，高50 mm）中，加入缓冲液（Buffer1）30 μL，涡旋混合，加入衍生试剂60 μL，涡旋混合15 s，样品管用石蜡膜封口，于55 ℃加热10 min，取出放冷至室温，转移至微量进样管中，精密量取2 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图至60 min；另精密量取混合对照品溶液10 μL，同法衍生操作并测定。

1.4 方法验证

1.4.1 专属性试验

制备对照品溶液、供试品溶液和测试溶液。精密量取2 μL，注入高效液相色谱仪，记录色谱图。

1.4.2 系统适用性试验

配制并衍生测试溶液。精密量取2 μL，注入液相色谱仪，连续进样6次，记录色谱图。

1.4.3 线性范围试验

取甘氨酰-D-谷氨酰胺适量，精密称定，置量瓶中，加超纯水制成浓度约为45 μg/mL的溶液。量取该溶液适量，加超纯水依次稀释，分别制成0.450 μg/mL、2.250 μg/mL、3.600 μg/mL、4.500 μg/mL、5.400 μg/mL、6.750 μg/mL的线性溶液。分别精密量取10 μL，按照“专属性”项下方法衍生。分别精密量取2 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。

1.4.4 灵敏度试验

（1）检测限试验。精密量取定量限溶液3 mL，置10 mL量瓶中，加超纯水溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取10 μL，按“专属性”项下方法衍生得相应溶液，精密量取2 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。

（2）定量限试验。精密称取甘氨酰-D-谷氨酰胺对照品适量，加超纯水溶解并逐步稀释，精密量取10 μL，按“专属性”项下方法衍生得相应溶液，精密量取2 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。

1.4.5 精密度试验

（1）重复性试验。配制并衍生甘氨酰-D-谷氨酰胺对照品溶液和6份测试溶液。分别精密量取2 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。

（2）中间精密度试验。由不同试验人员配制并衍生甘氨酰-D-谷氨酰胺对照品溶液和6份测试溶液。使用不同试验仪器于不同试验日期进行试验，平行测定6份测试溶液，将6份测试溶液中甘氨酰-D-谷氨酰胺测得含量与精密度试验中所测得结果进行比较，考察本方法中间精密度。

1.4.6 准确度试验

取甘氨酰-D-谷氨酰胺对照品约22.5 mg，精密称定，置50 mL量瓶中，加超纯水溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取2 mL，置20 mL量瓶中，加超纯水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液。

取本品约60 mg，精密称定，分别置20 mL量瓶中，各加入甘氨酰-D-谷氨酰胺对照品贮备液1.6 mL，2.0 mL，2.4 mL，加超纯水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得相应的80%、100%、120%的样品加样回收率溶液。

每个浓度的溶液各配制3份。分别精密量取上述溶液各10 μL，按“专属性”项下方法衍生得相应溶液，精密量取2 μL，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，计算甘氨酰-D-谷氨酰胺的回收率。

1.4.7 溶液稳定性试验

按“1.3.1”步骤，配制并衍生甘氨酰-D-谷氨酰胺对照品溶液和测试溶液。分别在衍生0 h、4 h、8 h、12 h和19 h后，精密量取2 μL，注入液相色谱仪。

1.4.8 耐用性试验

（1）柱温的变化范围考察。在其余检测条件不变的情况下，改变柱温（18～22 ℃），考察柱温的改变对检测结果的影响。

（2）流动相流速的变化范围。在其余检测条件不变的情况下，改变流动相流速（0.18～0.22 mL/min），考察流速的改变对检测结果的影响[4]。

图1 专属性试验色谱图

2 结果与分析

2.1 专属性试验

如图1所示，在溶剂的色谱图中未出现甘氨酰-D-谷氨酰胺色谱峰，表明溶剂不影响甘氨酰-D-谷氨酰胺的测定，测试溶液中甘氨酰-L-谷氨酰胺与甘氨酰-D-谷氨酰胺分离度符合要求，本方法专属性良好。

2.2 系统适用性试验

如表1所示，甘氨酰-D-谷氨酰胺峰面积RSD（%，n=6）值为3.06，甘氨酰-D-谷氨酰胺理论塔板数和拖尾因子均符合要求，甘氨酰-L-谷氨酰胺和甘氨酰-D-谷氨酰胺峰分离度符合要求，表明本方法系统适用性良好。

2.3 线性范围试验

以浓度（μg/mL）与峰面积进行线性回归，得回归方程为y=13 477x+90.537，R2=0.998，表明甘氨酰-D-谷氨酰胺在0.450～6.75 μg/mL的范围内线性关系良好。

图2 甘氨酰-D-谷氨酰胺线性回归曲线

2.4 灵敏度试验

2.4.1 检测限试验

当甘氨酰-D-谷氨酰胺浓度为135.0 ng/mL时，响应值约为噪音的4.0倍，经计算，本测定条件下甘氨酰-D-谷氨酰胺的检测限为101 ng/mL，约相当于供试品溶液的0.003%。

2.4.2 定量限试验

当甘氨酰-D-谷氨酰胺浓度为450.0 ng/mL时，响应值约为噪音的10倍，经计算，本测定条件下甘氨酰-D-谷氨酰胺的定量限为435 ng/mL，约相当于供试品溶液的0.01%。

2.5 精密度试验

2.5.1 重复性试验

6份测试溶液中甘氨酰-D-谷氨酰胺测得的含量分别为 4.161 μg/mL、4.360 μg/mL、4.246 μg/mL、4.227 μg/mL、4.143 μg/mL 和 4.264 μg/mL，RSD（%，n=6）值为1.85，表明该方法重复性良好。

2.5.2 中间精密度试验

如表2所示，12份测试溶液中甘氨酰-D-谷氨酰胺测得的含量RSD（%，n=12）值为2.51，表明该方法中间精密度良好。

2.6 准确度试验

如表3所示，各个浓度的回收率均在90.0%～100.0%，平均回收率为94.9%，RSD（%，n=9）为3.14，表明本方法准确度良好，试验结果可靠。

表1 系统适用性结果

表2 甘氨酰-D-谷氨酰胺中间精密度试验测定结果

表3 甘氨酰-D-谷氨酰胺样品加样回收率试验结果

表4 测试溶液稳定性试验结果

2.7 溶液稳定性试验

如表4所示，测试溶液中甘氨酰-D-谷氨酰胺测得的含量RSD（%，n=5）为2.91，表明测试溶液在室温下保存，至少19 h内稳定。

2.8 耐用性试验

如表5和表6所示，柱温为18～22 ℃和流速为0.18～0.22 mL/min时，对甘氨酰-D-谷氨酰胺测定无显著性影响。

表5 甘氨酰-D-谷氨酰胺柱温变化范围考察结果

表6 甘氨酰-D-谷氨酰胺流动相流速变化范围考察结果

3 结论

本文采用HPLC法成功实现了甘氨酰-L-谷氨酰胺与甘氨酰-D-谷氨酰胺的分离测定，操作简便、准确、灵敏度高、专属性强、干扰小，并通过方法学验证了该法对甘氨酰-D-谷氨酰胺测定的准确性和可靠性，对甘氨酰-L-谷氨酰胺的安全性、有效性起到了保证作用，适用于甘氨酰谷氨酰胺中甘氨酰-D-谷氨酰胺的控制分析。