山楂饮片及炮制品的HPLC指纹图谱研究

王紫馨，万军，李怡然，姜瑞文，夏满琼，周霞

(西南交通大学生命科学与工程学院，四川 成都 610031)

山楂为蔷薇科植物山里红CrataeguspimiatificiaBge.var. major N, E. Br, 或山楂CrataeguspinnatifidaBge干燥成熟果实[1]，具有消食健胃、行气散瘀、化浊降脂等功效。山楂炮制品主要有净山楂、焦山楂、山楂炭等[2]。目前，针对山楂的研究主要是有机酸、黄酮等成分的含量检测，以及对生品的指纹图谱研究[3]，而对其炮制品成分整体变化的研究尚未见文献报道。本研究拟采用HPLC法对山楂及其炮制品进行研究，建立指纹图谱，旨在较全面反映山楂饮片整体质量，区分山楂饮片及不同炮制品，为山楂饮片质量控制提供实验依据。

1 仪器与材料

安捷伦1260型高效液相色谱仪(安捷伦科技中国公司)；YP2002型电子天平(常州市衡正电子仪器有限公司)；SB-4200D超声波清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司)；SHZ-D3予华牌循环水真空泵(巩义市予华仪器有限公司)。

5-羟甲基糠醛(5-HMF)对照品(批号：MUST-18031202)、绿原酸对照品(批号：MUST-18030620)、金丝桃苷对照品(批号：MUST-17101605)，纯度均在99.00%以上，均购自成都曼思特生物科技有限公司。水为超纯水，乙腈、甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯。

共收集山楂饮片11批，见表1。焦品按照《中国药典》2015年版一部[1]炮制方法制备，炭品按照《中国药典》2015年版四部炮制通则[4]制炭方法制备，得到11批焦山楂及山楂炭。

表1 不同山楂饮片的采购信息

2 方法与结果

2.1 色谱条件

参考文献[3,5-6]并结合预实验，采用以下色谱条件：Kromasil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；检测波长为325 nm；柱温为30 ℃；流速为1 mL/min；进样量为20 μL；流动相为乙腈(A)，0.1%乙酸水溶液(B)，梯度洗脱(0～15 min，5%～10%A；15～30 min，10%～24%A；30～50 min，24%～40%A)。

2.2 对照品溶液的配制

称取5-HMF、绿原酸、金丝桃苷对照品适量，分别置10 mL容量瓶中，加入甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，即得。

2.3 供试品溶液的配制

精密称取山楂饮片粉末(过四号筛)1.0 g，置50 mL锥形瓶中，加入20 mL甲醇，超声处理50 min，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度试验 精密称取山楂饮片样品(批号S1)1.0 g，按“2.3”项方法制成供试品溶液，按“2.1”项色谱条件连续进样6次，结果共有峰保留时间RSD值均<1.0% ，峰面积RSD值均<1.0%，表明仪器精密度良好。

2.4.2 稳定性试验 精密称取山楂饮片样品(批号S1)1.0 g，按“2.3”项方法制成供试品溶液，分别于0、3、6、12 h按“2.1”项色谱条件测定，结果共有峰保留时间RSD值均<1.0%，共有峰峰面积RSD值均<1.0%，表明供试品溶液在12 h内检测稳定。

2.4.3 重复性试验 精密称取山楂饮片样品(批号S1)1.0 g，按“2.3”项方法制成供试品溶液，按“2.1”项色谱条件测定，结果共有峰保留时间RSD值均<1.0%，共有峰峰面积的RSD值均<1.0%，表明该方法重复性良好。

2.5 样品指纹图谱的建立

称取11批山楂生品、焦品及炭品，按“2.3”项方法制成供试品溶液，按“2.1”项色谱条件测定，色谱图见图1-3。可见，在生山楂图谱中共标示出14个特征峰；在焦山楂图谱中共标示出12个特征峰，与生山楂相比，其中包含10个共有峰及炮制后生成的2个新特征峰(峰1、峰16)；在山楂炭图谱中共标示出10个特征峰，与生山楂相比，其中包括8个共有峰及炒炭后生成的2个新特征峰(峰1、峰16)。经与对照品确认，山楂饮片指纹图谱中共归属2个特征峰，分别为绿原酸和金丝桃苷；焦山楂、山楂炭指纹图谱中共归属3个特征峰，分别为5-HMF、绿原酸、金丝桃苷，见图4。

84.6263.4742.3121.160.00mAUS11S114.4921.7428.9936.2343.4850.730.007.25t/min

14.4921.7428.9936.2343.4850.730.007.25t/minS11S1161.24121.1080.9740.830.70mAU

14.4921.7428.9936.2343.4850.730.007.25t/minS11S1179.97120.0260.470.92mAU

2.6 生山楂、焦山楂及山楂炭饮片指纹图谱的比较

通过对比山楂及炮制品的指纹图谱发现，14个峰均有一定变化。对比生山楂和焦山楂饮片指纹图谱，其中有10个共有峰和2个新生成的峰，峰4、峰7、峰8、峰14几乎消失，新生成峰1、峰16。对比生山楂和山楂炭饮片指纹图谱，在生山楂饮片中峰面积相对较高的峰5、峰12、峰13在炒炭后峰面积分别降低了2、7、6倍，4号、7～9号、11号、14号色谱峰面积大幅度下降。山楂和山楂炭饮片指纹图谱中有8个共有峰及2个新生成的峰，其中除峰10外，差异极为显著，新生成峰1、峰16。炒炭前后色谱峰数目、峰面积均发生显著变化。

ABCR

山楂炭与山楂饮片归属的特征峰相比，在山楂炭指纹图谱中峰3(5-HMF)的峰面积相对较高。峰3、峰5、峰12在炒炭前后含量变化幅度极为显著，由此推断山楂炒炭后机理变化与这三种成分有密切关系。山楂饮片经炮制后，生成新物质5-MHF，但随炮制程度逐渐分解，含量下降。绿原酸、金丝桃苷含量随炮制程度逐渐下降，见表2。

表2 山楂炮制前后特征峰峰面积变化

2.7 相似度评价

采用国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2012.130723版软件，以S1的图谱为参照，采用平均数法分别生成11批山楂饮片拟合图谱(图4)，以拟合图谱为对照分析11批山楂生品及炮制品饮片样品相似度，结果见表3。可见，不同批次的山楂饮片指纹图谱相似度均较高(大于0.9)，说明市场上销售的山楂质量较稳定。

表3 11批山楂饮片及其炮制品的指纹图谱相似度评价

3 讨论

3.1 色谱条件的选择

本文考察了多种提取溶剂、提取次数(超声次数)、提取时间[6-7]的提取效果，结果显示提取方法为甲醇超声提取50 min时，各色谱峰稳定且峰形较好，所以选择甲醇为提取溶剂。同时考察了流动相、柱温，发现采用0.1%乙酸水溶液和乙腈作为流动相，各色谱峰得到较好的分离，柱温30 ℃特征峰分离度较好。

考察了238、254、265、295、305、325、355、390 nm 8个波长下的色谱图[3,5]，结果显示325 nm波长下山楂的图谱信息量大，色谱峰多，基线平稳，分离度及峰形均较好，故选择325 nm作为检测波长。

3.2 指标成分的选择

根据 11批山楂饮片及其炮制品HPLC图谱分析，发现生品与焦品、炭品均有8个共有峰。在分析生品以及炮制品的共有峰时，选择了响应值最高的5号峰(绿原酸)作为参照峰(S)，计算各共有峰的峰面积和保留时间，结果显示共有峰保留时间的RSD小于 1%，由图4可见各共有峰面积相差较大，表明各饮片成分相似，但共有成分的相对质量分数有一定差异。

绿原酸(有机酸类)、金丝桃苷(黄酮类)均为山楂生品中有效活性成分[8,13-15]，绿原酸有抗氧化、保护心血管等作用，金丝桃苷具有抗感染、对心、脑血管的保护作用等多种生理活性，而5-HMF为炮制品中主要活性成分，可能具有凝血作用[9-12]，以上3种成分在设立的指纹图谱中都有较清晰的显示，可作为指标性成分。

3.3 共有峰与相似度评价

本研究采用HPLC法建立了山楂不同炮制品的指纹图谱，分别以山楂及炮制品的有效成分5-HMF、绿原酸、金丝桃苷为指标性成分，确立了8个共有峰。山楂相似度评价结果表明，11批供试品的 HPLC指纹图谱相似度高，相似度大于0.9，符合中药指纹图谱的技术要求，各个共有峰出峰时间相对平稳，峰形理想，可将此作为控制山楂质量的依据之一。除指标成分外，还发现其他色谱峰面积也有改变，后续可对其成分开展进一步研究。