类器官的培养及应用的研究进展

苏泽莹,管柳柳,陈斯泽，3

(1.广东药科大学附属第一医院肿瘤科； 2.广东省食管癌精准治疗工程技术研究中心； 3.广东药科大学附属第一医院科学研究中心，广东 广州 510080)

类器官是由多系细胞组成的体外三维培养物，是由干细胞驱动而以自组织的方式而构建形成，能够模拟天然器官结构和功能[1]。与传统二维培养物相比，类器官更能模拟体内细胞运动及多细胞间信号交流，且能在扩增中维持基因稳定性。与动物实验相比，类器官能模拟动物实验不易或不能准确代表的人体发育和疾病的发生发展过程，并可实现实时成像和更为符合实验伦理要求[2](表1)。

类器官的提出起源于Clever(2009)等[3]对小肠干细胞分离培养，且实验表明单个干细胞可以以自组织形式构建成肠道的隐窝绒毛结构。其培养原理主要来自对干细胞巢的理解。干细胞周围的细胞可构成微环境，即干细胞巢。在正常肠上皮，巢因子分布于干细胞周围，并形成浓度梯度，离干细胞巢距离越远则巢因子浓度越低，而促进分化因子浓度越高。体外构建类器官即是对干细胞巢的构建，并且其中添加的巢因子缺一不可。体外培养时提供因子重建干细胞巢，从而形成类器官。此后，类器官技术引起科学家的重视。近10年来，先后有不同研究相继建立不同的类器官，使类器官技术得到发展，并在逐步研究中探讨和解决类器官中的相关难题。

表1 3种疾病模型优缺点比较

1 类器官的培养来源

类器官的建立可来源于多能干细胞、胚胎干细胞和成体干细胞。目前，由多能干细胞和胚胎干细胞得到的类器官主要有：视杯[4]、脑[5]、视网膜[6]、肺[7]、肝脏[8]和肾脏[9]。理论上，多能干细胞和胚胎干细胞可形成所有类器官。而目前研究重点在于如何使其按照类似胚胎发生的方向形成类器官，其主要应用于研究相关器官的发生和发育问题。由成体干细胞培养成功的类器官主要有：肠道[3]、胃[10]、肝脏[11]、胰腺[12]和前列腺[13]、膀胱[14]、输卵管[15]、卵巢[16]、食管[17]。成体干细胞来源的类器官研究重点在于鉴定、分离，以及通过对生态位的控制使其沿特定方向分化，其主要用于研究相关的组织生物学问题。

另外，近年来，肿瘤干细胞假说也得到认可及证实[18]。肿瘤干细胞，可类似地将其视为具有组织特异性的成体干细胞。研究者按照与正常类器官相似的培养方法也构建了结肠癌[19]、前列腺癌[20]、胰腺癌[21]、食管癌[22]等类器官。由于肿瘤干细胞被认为是肿瘤整个微环境的构建者，由此提出：类器官不仅仅单纯模拟天然器官，在针对疾病模拟方面，更是疾病的浓缩与概括。

如上所述，对于研究所需的类器官，理论上可由多种起源细胞培养而成。然而，在实际的实验研究中，却需要对起源细胞进行选择(表2)。对于不同研究目的，研究者也会选择特定阶段的起源细胞，从而更好地达到研究目的。至今，一些类型的类器官仅来源于多能干细胞，包括神经外胚层类器官，如视杯和大脑，以及中胚层肾脏器官。表面外胚层谱系(特别是腺体组织)的类器官主要来源于成体干细胞。内胚层谱系的大多类器官都来源于多能干细胞和成体干细胞。而肿瘤类器官，可由肿瘤干细胞而来，也可由成体干细胞经基因编辑而来[23]。

由于类器官现存的长期培养的局限性及细胞本身的因素，导致不同起源细胞的选择将决定不同的细胞成熟度及细胞命运。例如，研究表明[24],多能干细胞来源的胃和肺器官的转录组与胎儿的转录组更接近。此外，基于RNA序列的转录图谱证实，人多能干细胞来源的小肠器官与胎儿组织最相似[25]。同样，从肝发育的重要调节因子的表达来看，多能干细胞产生的肝细胞或肝类器官与早期胎儿肝脏的关系比成人肝脏更为密切[8,26]。由于与胎儿相似，来源于人多能干细胞的组织可能更适合于发育研究而不是成人过程的研究。因此，在设计实验和实施这样的系统时，要考虑每个系统的实验优势和局限性，从而选择合适的起源细胞以培养实验相关的类器官。同时，针对长期培养的局限，也有研究取得进展，相关研究报道已成功构建可维持至少半年的成年小鼠皮肤类器官[27]。

2 类器官的培养环境

理论上，根据体内器官形成的机制，类器官的构建依靠自组织的形式。类器官自组织指的是无序结构的细胞系统在系统自主机制引导下的空间重组。自组织主要分为2个过程：自我模式化及形态重排。自我模式化是初始同质系统中细胞分化模式的形成，这是系统自治机制和局部细胞间通讯的结果。形态重排是组织内不同细胞类型的分类和系统结构的更高层次重组的结果。类器官的构建依赖于这两个过程的成功实现，因此在体外培养是需要考虑到实现自组织所需要的条件，包括物理环境和化学条件。

表2 构建类器官的不同起源细胞的比较Table 2 Comparison of different staring cells to construct organoids

2.1 培养的物理环境

细胞在体外生长依赖于细胞黏附和细胞骨架[29]，由于类器官是三维结构，因此需要相应环境的支持。目前，促使类器官形成三维特性最常见方法是使用支持细胞生长和细胞可以黏附的固体细胞外基质。现今实验室细胞外基质仍是主要使用天然的细胞外基质，其主要优点是存在细胞外基质成分和生长因子的结合，可有效促进细胞的生长和分化。然而，这种复杂性和成分的可变性也使得控制培养环境更加困难，并且可能降低再现性。其中，Matrigel(基质胶)是目前应用最广泛的三维有机体衍生基质。由于天然细胞外基质存在的缺陷，也有相关研究[30]提出了引入实验室化学合成的细胞外基质-化学水凝胶来进行类器官培养，以替代成分不太明确的天然基质；针对不同水凝胶对类器官体系的适用性也进行了比较[31]。此外，据研究显示，针对某类特定类器官，如视杯、大脑、小脑和海马等神经外胚层类器官，其培养方式为三维细胞聚集体的悬浮培养。理论上，干细胞在不进行外界干扰的情况下可自主分化为神经类器官。而该方式也没有利用固体支架，但某些条件下仍需添加低浓度的Matrigel以促进极化上皮结构的形成。对于多能干细胞培养成脑皮质类器官的稳定性问题，相关研究也提出分化培养方案[32]。还有特殊的类器官，如肾脏类器官，使用气液界面培养法进行构建。

对于不同类器官培养方案的确定，主要源于经验实验。实际上，由于缺乏对类器官培养方案的系统比较，因而对各种方案的优缺点及应用方面尚欠缺了解。

2.2 培养的化学条件

类器官培养所需的化学条件包括内源性信号和外源性信号。理论上，体内的类器官来源的细胞群体在规定的时间点暴露于特定的形态因子，从而引起所需的发育信号通路的激活。反过来，当系统中存在所有必要条件时，细胞群体中激活的这些信号可以触发自组织。因此，必须外部提供缺少的条件，自组织才能适当地进行，即外源性信号的添加。不同的类器官培养所需的内源性信号和外源性信号不同，其取决于细胞类型和细胞所处的生长阶段。例如，视杯类器官理论上可依靠内源性信号构建，实际研究中虽添加了低浓度的Matrigel,但仍主要依靠内源性信号形成。肾脏类器官的形成仅在形成输尿管上皮细胞和后肾间充质细胞的混合体是需要添加外源性信号因子，随后将自组织成肾脏类器官，而无需向培养基添加其他因子。胃类器官的构建则较为复杂，其需要特定的外源性因子来使定形内胚层分化朝后部前肠方向进行，随后需要进一步的外源性刺激引导细胞走向胃窦或胃底上皮命运，从而引导细胞生长、形态发生和分化为功能性的胃细胞类型。

体内和体外环境存在差异，纵然无法否认这些差异的存在，但许多特化功能仍可在体外培养中表达，因此，只要认识到类器官模型的局限性，充分发挥其优势，仍可使其在研究中发挥重要作用。

3 类器官的表征

类器官是不同细胞组成的复杂的三维结构，对于系统的建立，确定细胞的身份十分重要，从而保证类器官准确地代表人器官的结构和功能。类器官身份的鉴定，可从表型和基因型2个方面鉴定类器官与原始器官的同源性。

表型上，可通过H&E染色组织和器官切片进行组织病理学分析，以确定类器官的表型与靶器官是否一致。或通过免疫组织化学方法，根据生物标志物的表达进行确认。基因型上，使用全基因组测序(WGS)可作为当前的金标准来表征类器官基因组，包括拷贝数改变和体细胞突变。或者使用单细胞测序技术[33]比较类器官的转录图谱与靶器官的转录图谱。这种方法不仅提供了类器官内细胞身份的信息，而且还可以确定所选细胞类型的谱系轨迹。此外，还有RNA断层摄影[34]可以产生具有空间分辨率的细胞转录概况，从而提供关于器官结构内不同细胞类型的位置信息。

4 类器官的应用

4.1 组织生物学研究

在基础研究中，类器官可以用来研究发育、稳态和再生的原理。相比动物模型，类器官在研究器官发育上更具有实验可及性，有助于更好地理解器官生物学。Dotti等[35]和Howel等[36]分别构建出健康人和患者来源的肠类器官，并从基因水平上证实了这些类器官是研究人肠道发育分子调控机制的有利工具。Camp等[37]研究表明类器官中细胞的基因表达程序与相应的胎儿组织中的基因表达程序非常相似，这表明可以在类器官培养中研究人类靶器官发育的各个方面。Nakano等[38]利用多能干细胞构建出视杯类器官，该视杯类器官显示出人体视杯特有的特征，即其神经视网膜形成了多层组织，并包含视杆细胞和视锥细胞。这表明视杯类器官其组织形态变化可模拟人体视杯的发育。

另外，类器管的构建提供了简化且易得的“最小器官”，可用于研究不同组织成分对形态发生的影响。Farin等[39]利用肠道类器官研究wnt信号梯度在肠道中的作用，而在人体中paneth细胞是wnt等肠道肝细胞生态位信号的来源，通过该研究表明生理上paneth在肠道隐窝的空间限制决定了肠道干细胞的自我更新和分化命运。

4.2 疾病模型

类器官保留了体内器官的表型及其体外的可操作性，因此可用于构建更多疾病模型，且可进行药物筛选或构建生物库。

在研究疾病发生方面，如感染性疾病、炎症免疫性疾病、遗传性疾病、肿瘤等，此前多采用转化细胞系或动物模型，且在模型的再现性及重复性和伦理等方面都存在局限，以致给疾病药物研究带来阻碍。而类器官模型建立表明可运用类器官技术培养正常的人类器官模型，通过研究其致病机理，从而为研究治疗药物创造实验条件。例如：Schlaermann等[40]构建了人的胃类器官，模拟幽门螺旋杆菌病原体感染导致的炎症因子的升高现象，再现了感染时宿主-病原体之间的关系。Dekkers等[41]从囊性纤维化(CF)患者的内镜活检样本中培养出对应的类器官，验证了其与临床上的相似表型及对不同药物的特异性基因型应答。类器官还可通过结合第三代基因编辑技术CRISPR-Cas技术，对基因进行编辑，从而快速观察疾病表型的变化[42]。例如：Schwank等[43]结合CRISPR-Cas9基因编辑技术，修复了缺陷基因，恢复了类器官功能，为研究遗传性疾病提供新的方法和思路。另外，从肿瘤组织或肿瘤干细胞建立的类器官模型也可用于化疗及靶向药物筛选。目前，现有的模型无法测试抗血管药和免疫治疗药物，在参考PDX建立上，可构建PDOX模型，以补充这一方面模型的缺失，使药物测试更全面。并且，为达到个性化治疗，还可构建肿瘤生物库[44]。同时，对所建生物库的表征，可进一步证实类器官对靶器官的再现性，使生物库的建立意义更确信，为进一步的临床应用提供依据。现阶段，已有较完善的肿瘤生物库有大肠癌、胃癌、乳腺癌、膀胱癌、儿童肾癌。通过生物库的建立，可将生物信息与电子医疗记录(EMR)中的健康数据或通过监测技术获得的健康数据联系起来，为个性化治疗的实现提供实际可行的操作方案。Vlachogiannis等[45]采用先前参加过I期或II期临床试验的癌症患者的肿瘤类器官，把类器官对药物的反应与患者在临床上的实际反应进行比较。实验显示类器官具有与患者肿瘤相似的表型和基因型，这表明了类器官作为药物筛选和平台开发的价值。除对药物反应的研究外，目前对肿瘤反应性T细胞的产生和功能亦有限制，针对此，相关团队[46]通过将肿瘤类器官与自体外周血淋巴细胞共培养进行研究。

4.3 再生医学应用

健康或遗传校正后的患者供体细胞(如结合CRISPR-Cas9等基因编辑技术)所构建的类器官，可用作再生医学的细胞或组织来源[47]。类器官应用于再生医学有两大优势，一是来源多样，如成体干细胞、多能干细胞和胚胎干细胞；二是类器官和受体都来源于同个个体，可避免免疫排斥反应。并且，与运用体外培养细胞进行移植相比，类器官在生理上的结构和功能更接近原器官，因此可能更有利于移植，实现再生医学。

相关研究利用动物模型的移植实验探究类器官在再生医学上的可行性。例如，有实验研究[48]将小鼠胚胎干细胞或诱导多能干细胞衍生的3D视网膜组织进行移植，观察了宿主-移植物的突触连接，为晚期视网膜退行性疾病的视网膜片状移植治疗提供了证据，且研究结果显示与分离的胚胎视网膜后代相比，3D结构的移植物可更好地整合到宿主小鼠的视网膜中。基于该理论基础，Shirai等[49]培养人胚胎干细胞来源的视网膜，并将其移植到大鼠和灵长类的视网膜变性模型中，结果证实了其存活和成熟的能力，并与宿主组织显示出一定程度的整合。

5 类器官的未来及挑战

由于类器官与真实器官具有高度的结构和功能相似性，同时具有简化性及易获得性，因此可以用作研究中的代替品，这也将推动生物医学研究。但上述应用依赖于其在实验过程长期维持性及可大量重复性，目前在该项技术中针对这两方面的研究仍是重点及难点。此外，类器官虽能模拟与靶器官相似的结构与功能，但其本质仍是体外模型，缺乏与血管相关的联系。针对类器官的缺陷，相关研究也提出了与生物工程技术等结合的思考，例如器官芯片技术[50]。利用该技术微流控原理可对类器官及其微环境进行标准化和机械化，进而更好地进行控制和分析。且可利用集成系统的原理将多个类器官进行结合，更好地再现生理功能和结构。

未来的类器官技术将更加成熟，这将引导人类对生物的研究从基因组学到功能基因组学；从了解基因型与表型关系，到实现肿瘤精准、个性化治疗；从细胞、动物疾病模型到构建类器官模型；从传统的生物样本库到类器官生物样本库；从类器官到器官，最后实现器官再生。