金丝桃苷对糖尿病心肌损伤保护作用研究

刘兆祥，袁 宇，赵文婷，胡丽萍

(辽宁中医药大学 研究生学院，辽宁 沈阳 110847)

糖尿病心肌病(Diabetic cardiomyopathy，DCM)是由糖代谢紊乱触发心肌细胞学改变，导致亚临床心功能异常，并逐渐进展为心肌小血管病变、微循环障碍及心脏结构改变和心脏功能异常的疾病[1]。作为糖尿病(Diabetes mellitus，DM)状态下一种独立的心血管病变，该病最终可演变为充血性心力衰竭，甚至引发猝死，是DM患者死亡的主要原因之一。糖尿病心肌病最初被描述为糖尿病患者除高血压、冠心病、瓣膜性疾病及先天性心脏病等存在的情况下发生的心力衰竭，其概念由Rubler等在1972年首次提出[2]，他们发现在没有主要冠状动脉疾病的情况下，糖尿病患者出现了心源性增大和充血性心力衰竭。可见糖尿病可独立于其他致病因素，如冠状动脉疾病和高血压，直接影响心脏结构和功能诱发DCM，最终导致心力衰竭，并增加死亡率。该病早期以左室舒张功能异常为主，晚期则表现为左室收缩功能障碍，最终可引起心肌广泛灶性坏死，其主要病理改变包括心肌细胞外基质堆积，心肌肥厚及心肌间质纤维化[3-6]。

金丝桃苷又名槲皮素-3-O-β-D吡喃半乳糖苷，属于黄酮醇苷类化合物，是一种重要的天然产物[7]，广泛分布于各种植物中的果实与全草中。临床上含有金丝桃苷的药物有很多，大多为治疗心血管疾病的药物，除此之外金丝桃苷还具有抗炎、抗衰老、抗肿瘤[8]、抗抑郁、保肝、免疫调节[9]等多种作用。本实验研究金丝桃苷对高脂饮食结合小剂量链脲佐菌素(STZ)诱导的2型糖尿病小鼠心肌病变的影响，现报道如下。

1 材料与仪器

1.1 材料与试剂

C57BL/6J雄性小鼠(辽宁长生生物技术有限公司)；金丝桃苷(HyP)(沈阳康派特生物科技有限公司，纯度98%)；辛伐他汀(每片20 mg，杭州默沙东制药有限公司)；高脂饲料(沈阳市于洪区前民动物实验饲料厂)；链脲佐菌素STZ(美国Sigma Aldrich公司)；ELISA试剂盒(上海酶联生物科技有限公司)；Masson染色试剂盒(南京建成生物工程研究所)；异氟烷(深圳瑞沃德生命科技有限公司)。

1.2 仪器与设备

石蜡切片机(德国Leica公司)；酶标仪(美国Biotek公司)；高速冷冻离心机(德国eppendorf公司)；生物组织包埋机，烤片机(金华市益迪医疗设备有限公司)；上海ATP700(ST)电脑全自动脱水机；血糖仪及试纸条(美国罗氏公司)；彩色多普勒超声心动图仪HP7500(美国惠普公司)；光学显微镜(日本尼康Nikon公司)。

2 实验方法

2.1 动物模型的构建

5～6周龄C57BL/6J雄性小鼠50只适应性喂养1周后，正常组以普通饲料喂养；模型组以高脂饲料喂养4周，禁食不禁水约12 h，以100 mg/kg的剂量腹腔注射链脲佐菌素STZ，正常组小鼠腹腔注射等体积柠檬酸缓冲液，期间密切监测小鼠体重、血糖、尿液、摄食量、摄水量、毛发等变化。分别于造模实验开始后0周、6周、11周、16周、18周，禁食不禁水约12 h后称重。取鼠尾血用血糖仪测量空腹血糖值(FBG)，以空腹血糖值>13.89 mmol/L认为2型糖尿病小鼠造模成功[10-13]。

2.2 超声心动图检测小鼠心功能

小鼠用异氟烷吸入麻醉，采用超声检测仪检测射血分数(EF)、短轴缩短距(FS)、心率(HR)、心输出量(CO)、舒张期左心室内径(LVIDd)、收缩期左心室内径(LVIDs)、舒张期左室后壁厚度(LVPWd)、收缩期左室后壁厚度(LVPWs)、A峰与E峰之比(E/A)等。待检测到模型组小鼠射血分数(EF)、短轴缩短距(FS)值降低，左室内径增加，说明糖尿病心肌病小鼠造模成功[14]。

2.3 小鼠血清指标检测

干预8周后，摘取各组小鼠眼球血，高速冷冻离心机4 ℃离心取血清，生化法检测各组小鼠血清中总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、血糖(GLU)、乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)含量。ELISA法检测小鼠血清中肌钙蛋白I、SOD、MDA含量。

2.4 心肌组织形态观察

取小鼠心肌组织，放入多聚甲醛溶液中进行固定后制备石蜡切片并进行HE染色，放置显微镜下观察心脏组织的病理变化。Masson染色观察心肌组织纤维化情况。

2.5 统计学方法

采用SPSS25.0软件进行数据分析，计量资料数据以平均数±标准差表示，采用独立样本t检验进行比较，以P<0.05为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 各组小鼠状态比较

实验共选用 40只C57BL/6J小鼠腹腔注射STZ造模，在造模后72 h内死亡2只，剩余38只小鼠72 h后检测空腹血糖，共有34只小鼠空腹血糖高于13.89 mmol/L，糖尿病小鼠造模成功。

对照组小鼠在整个实验周期中状态良好，进食正常，体毛顺滑富有光泽。模型组小鼠前4周状态良好，体质量增加明显，注射STZ后质量迅速下降，进食量饮水量尿量显著增多，体毛量稀疏光泽度降低，反应迟缓活动量降低。与模型组小鼠对比，金丝桃苷组、辛伐他汀组小鼠的上述表现均不同程度减轻。于第16周，从每个实验组随机抽取8只小鼠进行心功能检测、血清胰岛素水平检测、组织学观察等。造模第16周，HFD+STZ组小鼠出现心室功能障碍，心肌细胞肥大，心肌纤维化。

3.2 超声心动图检测小鼠心功能

超声心动图结果如图1、表1所示，通过超声心动图检测显示，模型组小鼠心率减慢，短轴向缩短距(FS)和射血分数(EF)均有不同程度的降低，舒张期和收缩期左室内径(LVIDd)增加。结合生化检测仪分析血清肌酸激酶CK，乳酸脱氢酶LDH值异常升高，ELISA检测肌钙蛋白I含量增高，证明模型组小鼠心肌损伤存在，糖尿病心肌病(DCM)小鼠造模成功。由表1可知，与正常组比较，模型组EF、FS值显著降低(P<0.01)。HyP组与辛伐他汀组均可增加EF、FS值，其中辛伐他汀组效果优于HyP组，差异具有统计学意义(P<0.01)。

注：A为正常组，B为模型组，C为HyP组，D为辛伐他汀组。

表1 各组小鼠EF、FS比较

3.3 小鼠血清指标检测

血清指标检测结果如表2、表3、表4所示。与正常组相比，模型组小鼠的血糖(GLU)、乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)含量水平均显著升高，差异具有统计学意义(P<0.01)，TC值升高约162%，说明模型组小鼠血清中各生化指标严重紊乱，小鼠糖脂代谢紊乱，伴随出现进食量、进水量、尿量升高但体重减轻的明显三多一少症状，证明糖尿病小鼠造模成功。给药后各组指标出现明显好转，说明HyP组与辛伐他汀组具有保护心脏、改善糖脂代谢、调节小鼠血清TC、TG紊乱的作用。

表2 各组小鼠TC、TG、GLU含量比较

表3 各组小鼠HDL、LDL含量比较

表4 各组小鼠LDH、CK含量比较

3.4 小鼠血清ELISA检测结果

干预8周后，摘取各组小鼠眼球血，采用ELISA试剂盒检测各组小鼠血清中肌钙蛋白I、SOD、MDA含量。结果如下，由图2、图3、图4可知，与正常组相比，模型组小鼠SOD活力显著降低(P<0.05)，SOD是重要的抗氧化酶，可消除机体代谢过程中产生的有害物质。模型组中SOD活性显著降低，说明糖尿病小鼠的抗氧化能力减弱。给药后HyP组与辛伐他汀组SOD含量均明显升高(P<0.05)，说明HyP与辛伐他汀具有提高糖尿病小鼠抗氧化能力的作用；与正常组相比，模型组小鼠肌钙蛋白与MDA含量均显著增多(P<0.01)，MDA是反映脂质过氧化反应的重要指标，模型组小鼠MDA含量增加说明糖尿病小鼠脂质过氧化反应升高。给药后，HyP组和辛伐他汀组的MDA含量均降低，说明HyP和辛伐他汀能缓解脂质过氧化反应。肌钙蛋白I是一类高特异性的心肌损伤坏死的标志物。与正常组相比，模型组小鼠肌钙蛋白I含量显著升高(P<0.05)，提示糖尿病小鼠心肌已出现损伤，给药后，HyP组与辛伐他汀组肌钙蛋白I含量均降低，差异具有统计学意义(P<0.05)，说明HyP和辛伐他汀具有保护糖尿病小鼠心肌的作用。

图2 各组小鼠肌钙蛋白I含量的变化

注：与正常组相比，**P<0.01，*P<0.05；与模型组相比，##P<0.01，#P<0.05(n=8)。

图4 各组小鼠MDA含量的变化

3.5 心肌组织形态观察

取小鼠心肌组织，制备石蜡切片并进行病理研究，心脏组织HE染色结果如图5所示，Masson染色观察心肌组织纤维化结果如图6所示。由图5可知，正常组小鼠心肌细胞排列整齐，心肌细胞形态正常，细胞连接清晰染色均匀，细胞核呈卵圆形，细胞间界限清晰核明显，核呈蓝紫色，无肿胀坏死。与正常组相比，模型组小鼠心肌细胞排列紊乱，心肌细胞出现核裂解以及核丢失情况，细胞边界不清肥大坏死。给药干预后明显改善，肿胀坏死细胞数量明显减少，说明HyP与辛伐他汀对糖尿病小鼠心肌组织起到了保护作用。

注：A为正常组，B为模型组，C为中药组，D为西药组。

由图6可看出，光镜下观察小鼠心肌胶原纤维呈蓝紫色，小鼠心肌细胞核呈深蓝色。与正常组比较，模型组小鼠左心室心肌组织存在心肌纤维化，心肌胶原纤维增多，心肌细胞间隙增加，影响心肌收缩舒张功能。正常组小鼠心肌间质和血管周围均匀出现少量胶原纤维，模型组小鼠心肌间质和血管周围胶原纤维增多且排列紊乱，HyP组和辛伐他汀组小鼠心肌间质胶原纤维较模型组有效减少，对糖尿病小鼠心肌具有保护作用。

注：A为正常组，B为模型组，C为HyP组，D为辛伐他汀组。

4 讨论

根据国际糖尿病联盟(IDF)2017年统计数据显示，我国20～79岁人群中糖尿病患者有1.144亿，居世界首位，其中2型糖尿病占我国糖尿病患者的95%以上，病因包括胰岛素抵抗、胰岛素进行性分泌不足，或两者兼有。糖尿病患者长期处于高糖环境下，可直接促进心肌细胞蛋白的合成，进而诱发心肌细胞肥大，导致心脏舒张期延长以及收缩力下降，进而发展为糖尿病心肌病[15]。糖尿病心肌病的发病机制较为复杂，临床上常表现为不同程度的左室收缩和舒张功能不全，其中舒张功能受损常出现于收缩功能受损之前[16]，也可伴有心律失常，心源性休克甚至猝死。肌钙蛋白I、CK、CK-MB作为心脏损伤标志物，结合超声心动图和病理结果以及糖尿病小鼠造模条件，共同确定糖尿病引发了心肌损伤。SOD作为一种重要的抗氧化酶，能抑制心脑血管疾病抗衰老抗氧化，对糖尿病有明显的恢复作用。MDA是膜脂过氧化的终产物之一。

本研究通过高脂饮食联合腹腔注射STZ诱导的C57BL/6J小鼠DCM模型，腹腔注射STZ 1周后，小鼠空腹血糖值均持续高于13.89mmol/L，说明小鼠已经产生了胰岛素抵抗和胰岛功能受损，证实已成功建立2型糖尿病小鼠模型。实验结果表明，金丝桃苷能降低糖尿病小鼠空腹血糖，降低肌钙蛋白I、MDA含量，增加SOD含量，提高射血分数EF、短轴缩短距FS值，从而改善心肌功能，对糖尿病引起的心肌损伤具有保护作用。