联合运用染色体核型分析与CNV检测在超声结构异常胎儿中的应用价值*

张秀群 麦富巨 徐丹芬 赵卓姝 赖慧华 温倩敏

胎儿超声结构异常筛查多在妊娠11～13+6周进行，临床上常见合并染色体异常的胎儿超声异常种类包括胎儿心脏结构畸形、胎儿中枢神经系统畸形、胎儿泌尿生殖系统畸形、胎儿骨骼系统畸形、胎儿羊水量异常及胎儿软指标异常等；临床研究发现，有0.6%～1.9%的结构异常胎儿存在心脏结构异常，心脏畸形是导致新生儿死亡的重要因素之一，属于人类先天性缺陷的首位；而经胎儿超声诊断为先天性心脏病的患儿中，染色体异常率高达40%以上[1]。为深入分析超声结构异常胎儿的病理特征，提升其临床诊断价值，本研究利用染色体核型分析法与CNV 检测进行联合检测，就此展开针对性研究，并取得较为理想的临床研究价值，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择本院于2019 年1-12 月收治的137 例超声检测显示胎儿结构异常的孕妇为观察对象，孕妇年龄19～41 岁，平均（29.85±5.36）岁；孕周13～21 周，平均（20.49±3.72）周。（1）纳入标准：均符合超声诊断标准，超声异常胎儿存在明显的NT 增厚，无双胎妊娠，孕妇均无妊娠异常。（2）排除标准：存在先天性疾病；存在认知、行为异常；存在表达能力障碍；存在妇科肿瘤、妇科炎症。通过染色体核型分析与CNV 检测展开联合诊断。孕妇或家属均对本次研究内容知情同意，并签署知情同意书，且该研究已经本院伦理委员会批准。

1.2 方法 （1）本次研究选择的仪器为Illumina 公司的NextSeq-CN500 测序仪，试剂为贝瑞和康血浆游离DNA 提取试剂盒（磁珠法），测序反应通用试剂盒，胎儿染色体非整倍体检测试剂盒（可逆末端终止测序法），美国THERMO CO2培养箱，北昂LABB M9 全自动染色体扫描仪及分析系统、美国CHANG Amnio 羊水细胞培养基，以色列 BIOAMF-2羊水细胞培养基。（2）CNV-seq 检测：经知情同意后，在超声诊断仪的引导下，行羊膜腔穿刺术，抽取羊水20 mL，收集的标本送湖南家辉遗传病医院进行检测，使用北京贝瑞和康公司的科诺安试剂盒，按照标准流程操作进行DNA 提取→酶反应→纯化→文库纯化→文库质控→测序→生物信息分析。结果判读参照人类基因组hg19 版本和DGV、DECIPHER、OMIM、UCSCS 及PubMed 等数据库。结果判定根据相应标准分为：良性CNVs，临床意义不明确的CNVs（VOUS）和致病性 CNVs。对检测到亚显微结构异常的致病性CNV 和可能致病的CNVs，建议胎儿父母行CNV-seq 检测，以明确变异的遗传性质及相关临床意义。（3）染色体核型分析：经知情同意后，在超声诊断仪的引导下，行羊膜腔穿刺术，抽取羊水20 mL，按照本室常规方法进行细胞培养、染色体制备、G 显带及核型分析，必要时加做C 显带。每例计数30 个分裂相，分析6 个核型，嵌合体时计数50～100 个细胞，根据人类细胞遗传学国际命名体制标准进行核型分析诊断。

1.3 观察指标及判定标准 观察染色体核型分析联合CNV 检测结果，统计诊断符合率，并分析染色体核型分析的核型结果与CNV-seq 结果。（1）染色体核型分析判定标准：染色体核型分析以中期染色体为基础，根据染色体的长度、着丝粒的位置、长臂和短臂的长度以及卫星的存在与否对染色体进行分析、比较、排序和编号；如发现染色体存在数目畸变（非整倍体、多倍体）或结构畸变（缺失、重复、易位、倒位、环状染色体和等臂染色体等）的情况为异常（阳性）；没有以上所述的数目畸变或结构畸变为正常（阴性）。（2）CNV 检测：检测片段长度大于100 kb 的拷贝数复制、缺失情况，参照国际基因组CNV 多态性数据库Decipher、UCSC Genome Browser、Online Mendelian Inheritance in Man （OMIM）、International Standards for Cytogenomic Arrays（ISCA）等以及相关文献评估CNV 是否致病。①得到CNV 的结果，与序列数据库进行比对，能比对到数据库中，人群分别频率n≥1%，说明CNV为人群中比较常见多态性即非致病性CNV。对于没有比对到数据库中的结果进行下一步。②与基因组变异数据库（database of genomic variants）比对，数据库中出现正常次数n≥3，表明CNV 为正常多态性即非致病性CNV。针对n＜3 的CNV 进行下一步。③与已知微缺失微重复综合征比对，能比对到综合征的CNV 既致病性CNV。其他进行下一步。④进一步看CNV 涉及区域中是否包含重要功能基因，不包含基因或重要功能性基因的即为非致病性CNV；包含重要功能性基因进行下一步。⑤在网上数据库和文献中进行搜索，CNV 与疾病案例存在片段相同或包含该片段，且临床表型相似的CNV 即致病性CNV；假如没有重叠区域或有重叠但表型不一致，即为不明临床意义CNV。（3）联合检测判定标准：染色体核型分析与CNV 检测任一结果显示阳性即判定为异常（阳性）。

1.4 统计学处理 采用SPSS 19.0 软件对所得数据进行统计分析，计数资料以率（%）表示，比较采用χ2检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各种检测方式的异常检出率比较 本次研究发现，在137 例经超声检测显示胎儿结构异常的孕妇中，染色体核型分析对异常胎儿的检出率低于CNV检测以及联合检测。联合检测与染色体核型分析的检出率比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；CNV检测与染色体核型分析及联合检测的检出率比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 各种检测方式的异常检出率比较

2.2 胎儿染色体核型正常而CNV-seq 异常的结果 染色体核型结果显示正常的胎儿中，检测出有15 例CNV-seq 结果为异常，检出率为10.95%（15/137），其中已知致病性的CNVs 有8 例，其余7 例为VOUS。8 例致病性的CNVs 中，有4 例的CNV 均为16 号染色体短臂微缺失，其中3 例是16p11.2 微缺失，1 例缺失是16p12.2；2 例为X 染色体短臂微重复；1 例为19 号染色体短臂微缺失；1 例为X 染色体单体。7 例CNV-seq 结果为VOUS 的胎儿中，有3 例为22 号染色体长臂微缺失，1 例为22 染色体长臂微重复；1 例为9 号染色体短臂微重复；1 例为14 号染色体长臂微重复；1 例为15 号染色体长臂微缺失。见表2、3。

表2 染色体核型正常的8例致病性CNVs的B超情况与CNV-seq结果

表3 染色体核型正常的7例VOUS的B超情况与CNV-seq结果

3 讨论

临床研究统计我国新生儿出生畸形率约为3%，由此可见，我国具有较高的新生儿畸形率，因此开展妊娠期胎儿诊断在提升人口素质，降低新生儿畸形率、缓解社会负担方面具有十分重要的意义[2]。

随着临床超声仪器及检查技术的高速发展，针对早期胚胎的检出水平得到明显提升；通过超声系统筛查能够有效检出胎儿形态结构异常，同时还能够经由超声软指标观察胎儿身体状态。微小异常指超声下发现的胎儿解剖结构非特异微小变化，多属于正常变异，即软指标；与结构畸形相比，软指标预后良好，单独或同时出现多个微小异常在高危妊娠可能增加染色体畸形的风险，且多数微小异常随孕周增加而逐渐好转或消失[4]。胎儿超声结构异常多见于颈项透明层增厚，即NT 增厚，通常在妊娠11～13+6周时，胎儿颈背部会出现一层无回声带，为皮下组织内液体的积聚，在孕11 周时超过1.9 mm、孕12 周时超过2.1 mm、孕13 周时超过2.2 mm、孕11～13+6周时超过2.5 mm 均可判定为异常情况。针对NT 增厚与染色体异常，临床研究发现在孕早期所有的染色体异常均与NT 增厚有关，颈项透明层增厚越明显，发生胎儿结构异常与染色体异常的概率越大，同时NT 增厚与胎儿先天性心脏病高度相关。因此超声诊断能够通过检查心脏位置异常、心房和心室的结构异常、大血管的发育异常确定胎儿结构异常情况；同时通过判断间隔、房室瓣主动脉的发育结构，确定其畸形情况[3]。结合上述内容可知，胎儿的NT 超声检查在孕早期对不同发育异常情况均有一定的诊断价值，检出率超过1/3[4]。

染色体核型分析作为一种经典遗传学检测方式，指将待测细胞的染色体依照该生物固有的染色体形态结构特征，按照一定的规定，人为的对其进行配对、编号和分组，并进行形态分析的过程[5]。经血培养、制片、烤片、染色、扫片、阅片、审核及复审等过程，能够有效检出胎儿结构异常情况，且具有较高的准确率[6-7]。但其操作流程较为复杂、分辨率较低，对于医师的技术要求高，在检测中细胞生长状态及显带水平均是影响实验结果的主要因素。虽然在分子遗传学技术发展下，荧光原位杂交技术、荧光定量PCR 技术得到普及应用，但与染色体核型分析一样存在缺陷，即在检测来源未知染色体片段与染色体微缺失微重复鉴别时无法准确识别[8-9]。近年来，临床医疗水平不断提升，高通量测序技术高速发展，进一步推动了分子技术在遗传病检测、肿瘤检测、产前筛查、微生物病原体等方面的积极应用[10]；而CNV-seq 作为一种以高通量测序技术为基础的检测方式，在检测中不需要进行细胞培养，且对于探针种类选择、通量等无限制，具备通量高、成本低、操作简单、范围广泛的优势[11]。尤其在2019 年4 月所发布的《低深度全基因组测序技术在产前诊断中的应用专家共识》中指出，通过CNV-seq 检测有助于对染色体核型分析中存在的不足进行弥补，因此可用于一线产前诊断[12-14]。

本研究发现，通过染色体核型分析与CNV 检测，能够有效检出胎儿结构异常，辨识胎儿神经畸形状况，便于区分高危妊娠增加染色体畸形的风险，提示胎儿染色体及心血管方面的异常情况，以便于临床上及时采取有效的治疗措施[15-16]。染色体核型分析在137 例经超声检测结构异常胎儿中的异常检出率较CNV 检测与联合检测异常检出率更低，且CNV 检测胎儿异常检出率低于联合检测异常检出率。分析原因可知，G 显带染色体核型分析方式虽然能够对整套染色体数目与明显结构异常情况快速检出，但受制于分辨率较低的因素影响，对于片段长度在5 Mb 以下的结构异常情况难以准确检出[11，17]。而联合CNV-seq 则能克服现有染色体诊断技术中存在的缺陷，充分发挥协同作用，可以快速、准确检测出＞100 kb 以上的结构异常片段，对于染色体微缺失或微重复诊断效果理想[18]；因此染色体核型分析结合CNV-seq 检测的应用有助于为临床诊断提供更详细、准确信息，继而为遗传咨询及生育指导提供可靠依据。

综上所述，染色体核型分析与CNV 检测在超声结构异常胎儿中具有较高的临床应用价值，高危妊娠孕妇可通过染色体核型分析联合CNV 检测尽早筛查胎儿结构异常情况，从而提升临床控制效果，提升诊断准确率。