非瓣膜性心房颤动并发缺血性脑卒中病人NLRP3炎性小体与病情程度及预后的相关性分析

马春茂，兰德彬

非瓣膜性心房颤动(NVAF)是临床常见的心律失常之一，同时也是诱发缺血性脑卒中发作的重要独立危险因素[1]。近年来，相关研究显示，炎症可能参与了心房颤动引起的心房附壁血栓的形成，进而导致相关血栓栓塞事件的发生[2]。炎性小体NLRP3是免疫炎症反应的重要组成部分，其通过激活炎性通路，促进炎症反应的级联放大，有研究显示其参与了众多炎症性疾病如慢性阻塞性肺疾病、动脉粥样硬化等疾病的发生、发展过程[3-4]。NLRP3炎性小体的激活可导致促炎细胞因子如白细胞介素-1β(IL-1β)和白细胞介素-18(IL-18)的合成与分泌，同时激活半胱氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)凋亡通路，导致组织器官损伤及纤维化[5]。但NLRP3炎性小体能否有效预测NVAF并发缺血性脑卒中病人的病情严重程度及预后，相关临床研究尚未阐明。本研究通过分析NVAF及NVAF并发缺血性脑卒中病人外周血单核细胞NLRP3炎性小体水平的变化情况，探讨NLRP3炎性小体与NVAF并发缺血性脑卒中病人疾病严重程度及预后的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2012年1月—2018年9月彭州市人民医院收治住院的NVAF并发缺血性脑卒中病人160例作为观察组，其中男96例，女64例，年龄58.4～83.2(71.1±10.27)岁。纳入标准：24 h动态心电图提示持续或永久性心房颤动；超声心动图排除瓣膜性疾病；缺血性脑卒中的诊断满足第四届全国脑血管病学术会议制定的诊断标准。排除标准：心脏瓣膜性疾病、甲状腺功能亢进性心脏病、先天性心脏病等病人；严重肝肾功能不全病人；合并严重感染、自身免疫性疾病等可能对NLRP3炎性小体产生影响的病人。另选取同期160例NVAF无脑卒中病人为对照组。依据美国国立卫生研究院卒中量表(NIHSS)评分对观察组病情严重程度进行评分。根据观察组病人临床转归情况将其分为存活组(136例)与死亡组(24例)。该研究获得了四川省彭州市人民医院医学伦理委员会的批准，病人均签署知情同意书。

1.2 研究方法

1.2.1 病史采集 详细记录入选病人临床资料，包括年龄、性别、体质指数(BMI)，记录吸烟史、既往是否患有高血压、糖尿病、冠心病、心房颤动类型及心房颤动病程等。根据CHADS2及脑卒中风险评分(CHA2DS2-VASc评分)标准，计算其评分情况。

1.2.2 相关实验室指标检测 所有病人入院后次日清晨抽取空腹静脉血5 mL，采用罗氏全自动生化分析仪检测血常规、凝血常规、肾功能、生化常规等。

1.2.3 分离外周血单核细胞(PBMCs) 分别取观察组和对照组病人静脉血5 mL，置于EDTA抗凝管，按照1∶1比例与人外周血淋巴细胞分离液(美国Sigma公司)混匀后离心，分离外周血单抗细胞，将1 mL Trizol加入外周血单抗细胞中混匀后备用。

1.2.4 qRT-PCR检测炎性小体NLRP3及Caspase-1 mRNA水平 运用Trizol法提取两组外周血单抗细胞总RNA，测定RNA浓度，然后按逆转录试剂盒说明书(Takara公司)进行逆转录。其中qPCR引物由上海生工公司设计合成，NLRP3上游引物：5′-CATGAGTGCTGCTTCGACAT-3′，下游引物：5′-GCTTCAGTCCCACACAGA-3′；Caspase-1上游引物：5′-ATCGCTTTCTGCTCTTCCAC-3′，下游引物：5′-TCCTCCACATCACAGGAACA-3′；内参GAPDH上游引物：5′-AGACAGCCGCATCTTCTTGT-3′，下游引物：5′-CTTGCCGTGGGTAGAGTCAT-3′。依据TaKaRa公司提供的荧光定量PCR试剂盒说明书建立20 μL反应体系。结果分析以GAPDH为内参，计算两组相应基因的ΔΔCT值。

1.2.5 神经功能缺损程度评分 采用NIHSS评分，由专业神经内科医生对缺血性脑卒中病人神经功能缺损程度进行评分，依据NIHSS评分将观察组分为3组，NIHSS评分≤4分为低危组(56例)；NIHSS评分5～15分为中危组(54例)；NIHSS评分≥16分为高危组(50例)。

2 结 果

2.1 两组临床资料比较 两组年龄、性别、BMI、吸烟、高血压病、糖尿病、冠心病、心房颤动类型及心房颤动病程等方面比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。与对照组比较，观察组CHADS2和CHA2DS2-VASc评分水平明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。详见表1。

表1 两组临床资料比较

2.2 两组外周血单核细胞NLRP3和Caspase-1 mRNA水平比较 与对照组比较，观察组外周血单核细胞NLRP3和Caspase-1 mRNA水平升高(t=0.566，P<0.001；t=15.254，P<0.001)。详见图1。

图1 两组外周血单核细胞NLRP3和Caspase-1 mRNA水平比较

2.3 观察组不同危重组间外周血NLRP3 mRNA及NIHSS评分水平比较 低危组、中危组及高危组间外周血NLRP3 mRNA及NIHSS评分比较差异具有统计学意义(P<0.05)。高危组外周血NLRP3 mRNA及NIHSS评分水平最高，中危组次之，低危组最低，其中，两两组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。3组间病死率比较差异有统计学意义(P<0.05)，其中高危组病死率最高，中危组次之，低危组最低。详见表2。

2.4 观察组不同预后组间外周血NLRP3 mRNA和NIHSS评分比较 死亡组外周血NLRP3 mRNA和NIHSS评分水平高于存活组，差异具有统计学意义(P<0.05)。详见表3。

表2 不同危重组病人NLRP3mRNA、NIHSS评分及病死亡率比较

表3 不同预后组外周血NLRP3 mRNA和NIHSS评分比较 (±s)

2.5 相关性分析 观察组病人外周血NLRP3 mRNA水平与NIHSS评分(r=0.761，P=0.019)、CHADS2评分(r=0.695，P=0.025)及CHA2DS2-VASc评分(r=0.720，P=0.022)呈正相关。将外周血NLRP3 mRNA与病人死亡率进行等级相关分析，结果显示两者呈正相关(r=0.670，P=0.00)。

2.6 外周血NLRP3 mRNA水平对NVAF并发缺血性脑卒中病人预后诊断的ROC曲线分析 通过ROC曲线分析发现，外周血NLRP3 mRNA的曲线下面积(AUC)为0.842(0.751～0.932)，其最佳工作点(OOP)为1.43，敏感性为87.50%，特异性为81.03%。详见图2。

图2 外周血NLRP3 mRNA水平的ROC曲线

3 讨 论

随着我国人口老龄化进程的加快，NVAF已成为临床最常见的心律失常之一，并且其发生率正呈逐年上升趋势，相关研究显示，其发生率在0.4%～1.0%[6]。心房颤动是血栓栓塞事件发生的最重要危险因素之一，有研究显示，NVAF并发脑卒中的发生率是正常人的5～6倍，严重影响人们的健康及生活质量[7]。外周血NLRP3 炎性小体与NVAF并发缺血性脑卒中病人病情及预后的关系如何，目前的相关研究报道还不很充分。

NLRP3炎性小体是由胞浆内多种蛋白质组成的复合体，含有凋亡相关微粒蛋白、Caspase-1等。在机体正常情况下，机体NLRP3炎性小体活性处于抑制状态，但一旦机体处于炎症状态时，NLRP3炎性小体被激活，表达水平明显上调[8]。在本研究中，通过检测NVAF病人外周血NLRP3炎性小体水平，结果显示NVAF并发脑卒中病人外周血NLRP3炎性小体水平较普通NVAF病人明显升高，表明外周血NLRP3炎性小体可能与NVAF并发脑卒中的发生密切相关。通过相关性分析显示，外周血NLRP3炎性小体水平与病人NIHSS评分具有相关性，即外周血NLRP3炎性小体水平与NIHSS评分呈正相关，提示NVAF并发脑卒中病人外周血NLRP3炎性小体水平越高，其病情越危重。外周血NLRP3炎性小体水平升高引起NVAF并发脑卒中的发生，可能与多种因素相互作用有关。有研究证实，外周血NLRP3炎性小体可直接促进低密度脂蛋白的氧化及脂质的过氧化，引起氧自由基生成增加，损伤内皮细胞，造成内皮素及炎性因子的释放，促进动脉粥样硬化的形成，导致卒中发生[9]。其次，外周血NLRP3炎性小体可激活体内血小板，促进血小板的黏附与聚集，导致血栓形成[10]。

本研究进一步分析外周血NLRP3炎性小体与NVAF并发脑卒中病人预后的关系，根据临床结局，将病人分为存活组与死亡组，分析两组外周血NLRP3炎性小体水平的差异。结果显示，NVAF并发脑卒中死亡组外周血NLRP3炎性小体水平高于存活组，同时外周血NLRP3炎性小体与病人病死率呈正相关，提示外周血NLRP3炎性小体水平可有效反映NVAF并发脑卒中病人临床预后。通过进一步做外周血NLRP3炎性小体水平ROC曲线分析判断NVAF并发脑卒中病人预后，其曲线下面积较大，可作为判断预后的有效指标。针对NVAF并发脑卒中病人，通过检测外周血NLRP3炎性小体水平，不仅可作为评估病情严重程度及临床预后的有效指标，还可在一定程度上为临床治疗提供靶点。

综上所述，NVAF并发脑卒中病人外周血NLRP3炎性小体水平可有效反映病情严重程度及预后。但本研究也存在一定的局限性，由于NVAF并发脑卒中病人样本量偏小，需要进一步加大样本量，采取多中心分析外周血NLRP3炎性小体在评估NVAF并发脑卒中病人病情严重程度及预后的临床价值。